SABOURAUD AGAR: FUNDAMENT, PREPARARE ȘI UTILIZĂRI - BIOLOGIE - 2025

Agar Sabouraud , de asemenea , cunoscut sub numele de Sabouraud dextroză agar, este un mediu solid, în special îmbogățit pentru izolarea și dezvoltarea ciupercilor, cum ar fi drojdii, mucegaiuri și dermatofiți.

Prin urmare, acest mediu nu poate lipsi dintr-un laborator de microbiologie pentru a investiga prezența ciupercilor patogene sau oportuniste, fie din eșantioane clinice sau nonclinice. De asemenea, este ideal și pentru creșterea bacteriilor filamentoase precum Streptomyces și Nocardias. Utilizarea sa este foarte largă, deoarece poate fi folosită în micologia umană, animală, vegetală și industrială.

A. Agar Sabouraud nevazut. B. Sabouraud agar însămânțat cu o drojdie. Sursa: Fotografii realizate de autor MSc. Marielsa gil

Acest mediu a fost creat în 1896 de renumitul dermatolog Raimond Sabouraud, care a devenit un specialist de renume mondial în tulburări ale scalpului, cauzate în principal de dermatofite.

Creația sa a fost atât de importantă încât a fost folosită de atunci și rămâne și astăzi, deși cu unele modificări.

Deși este special pentru ciuperci, bacteriile pot crește în acest mediu, prin urmare, pentru probele cu flora mixtă, includerea antibioticelor în prepararea lor este necesară pentru a inhiba creșterea florei bacteriene care poate fi prezentă.

Alegerea antibioticului trebuie făcută cu atenție și ținând cont de tipul de ciupercă care trebuie recuperată, deoarece unele sunt inhibate în prezența anumitor substanțe.

Bază

Agoura de dextroză Sabouraud este un mediu care în formularea sa inițială este slab selectiv, datorită pH-ului său acid de 5,6 ± 0,2, cu toate acestea, bacteriile se pot dezvolta în continuare, în principal în incubări prelungite.

Mediul conține peptonă de cazeină și digestie pancreatică a țesutului animal, care asigură sursa de carbon și azot pentru creșterea microorganismelor.

De asemenea, conține o concentrație mare de glucoză, care acționează ca o sursă de energie, promovând creșterea ciupercilor peste bacterii. Toate acestea amestecate cu agar-agar, o componentă care îi conferă consistența corectă.

Pe de altă parte, agoura de dextroză Sabouraud poate fi selectiv dacă se adaugă antibiotice.

Cu antibiotice este util mai ales în probe de răni, ulcere deschise sau orice probă în care este suspectată o mare contaminare bacteriană.

Cele mai utilizate combinații de agoura de dextroză Sabouraud cu antibiotice

-Saburaud agar cu cloramfenicol: ideal pentru recuperarea drojdiilor și a ciupercilor filamentoase.

- Agoura Sabouraud cu gentamicină și cloramfenicol: aproape toate ciupercile și drojdiile filamentoase cresc în acest mediu și inhibă un număr mare de bacterii, inclusiv Enterobacteriaceae, Pseudomonas și Staphylococcus.

- Agoura Sabouraud cu cicloheximid: este util în special pentru probele de la nivelul pielii sau ale tractului respirator, atâta timp cât suspiciunea este ciuperci dimorfice.

Cicloheximida trebuie utilizată cu precauție; Deși este utilizat pentru a inhiba creșterea ciupercilor și a drojdiilor nepatogene sau de mediu care pot fi prezente ca contaminanți într-un eșantion, inhibă și creșterea unor ciuperci precum Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Allescheria boydii, Penicillium sp și alți ciuperci oportuniste.

- Agoura Sabouraud cu cloramfenicol plus cicloheximid: este utilizat în principal pentru izolarea dermatofitelor și a ciupercilor dimorfice. Are dezavantajul că inhibă unele specii de ciuperci oportuniste, precum Candida no albicans, Aspergillus, Zygomycetes sau C. neoformans.

- Agoura Sabouraud cu cloramfenicol, streptomicină, penicilină G și cicloheximidă: este ideal pentru probele extrem de contaminate cu bacterii și ciuperci saprofite, dar are dezavantajul că inhibă creșterea Actinomicilor și Nocardiilor, pe lângă ciupercile oportuniste menționate mai sus.

preparare

Dacă aveți ingredientele separat, acesta poate fi preparat după cum urmează:

Sabouraud dextroză agar

A cantari:

- 40 gr de dextroză

- 10 g de peptonă

- 15 gr de agar-agar

- Măsurați 1000 ml de apă distilată

Toate ingredientele sunt amestecate, pH-ul este ajustat la 5,6. Soluțiile sunt dizolvate prin fierbere, 20 ml de mediu se distribuie în tuburi de 25 x 150 mm, fără jante și, de preferință, cu un capac de bumbac.

Tuburi cu capac din bumbac. Sursa: Fotografie realizată de autor MSc. Marielsa gil

În plus, în funcție de disponibilitate, pot fi utilizate și alte dimensiuni ale tubului.

Acestea sunt autoclavate timp de 10 minute într-o atmosferă de presiune (121 ° C). Timpul de autoclavare nu trebuie depășit. La ieșirea din autoclav, tuburile sunt înclinate cu ajutorul unui suport până se solidifică într-un cioc de flaut.

Un alt mod este de a dizolva ingredientele prin încălzire până când fierbe. Autoclavează 10 minute în același flacon și apoi distribuie 20 ml în vasele Petri.

Dacă aveți un mediu de agar dextrosă Sabouraud care conține deja toate ingredientele, continuați să cântăriți cantitatea specificată de societatea comercială pentru un litru de apă. Restul etapelor sunt aceleași cu cele descrise mai sus.

Sabouraud dextroză agar (modificare Emons)

A cantari:

- 20 gr de dextroză

- 10 g de peptonă

- 17 gr de agar-agar

- Măsurați 1000 ml de apă distilată

Toate ingredientele sunt amestecate, pH-ul este ajustat la 6,9. Procedați în același mod ca și cazul anterior.

Există case comerciale care oferă mediul cu toate ingredientele. În acest caz, cântăriți și pregătiți așa cum este descris pe insert.

Sabouraud dextroză agar (modificare Emons) cu cloramfenicol

Soluție de stoc cloramfenicol

- Cântărește 500 mg de bază cloramfenicol

- Măsurați 100 ml etanol 95%

- Amesteca

Mediul de agar de dextroză Sabouraud (Emmons) este preparat așa cum s-a descris anterior și, în plus, pentru fiecare litru de mediu, se adaugă 10 ml de soluție stoc de cloramfenicol înainte de efectuarea autoclavării.

Sabouraud Emmons Dextroză Agar cu cicloheximidă

Soluție de stoc cicloheximid

- Cântărește 5 gr de cicloheximidă

- Măsurați 100 ml acetonă

- Amesteca

Mediul de agar de dextroză Sabouraud (Emmons) este preparat așa cum s-a descris deja și, în plus, pentru fiecare litru de mediu, se adaugă 10 ml soluție stoc de cicloheximidă înainte de efectuarea autoclavării.

Agoura de dextroză Sabouraud (Emoni) cu cloramfenicol și cicloheximidă

Mediul de agar de dextroză Sabouraud (Emmons) este preparat așa cum s-a descris anterior și, în plus, pentru fiecare litru de mediu se adaugă 10 ml de soluție stoc cloramfenicol și 10 ml soluție stoc de cicloheximidă înainte de autoîncărcare.

Alte antibiotice care pot fi adăugate

20.000 până la 60.000 de unități de penicilină pe litru de mediu.

30 mg streptomicină pe litru de mediu.

Ambele trebuie încorporate după ce mediul a fost autoclavat, ușor răcit (50-55 ° C).

0,04 g neomicină pe litru de mediu.

0,04 g gentamicină pe litru de mediu.

Consideratii speciale

Pentru siguranță, este de preferat să semeni agoura de dextroză Sabouraud în tuburi în formă de pană (înclinate în ciocul de flaut), mai degrabă decât în ​​vasele Petri, pentru a evita dispersia și inhalarea sporilor.

Este important ca tuburile de agar Sabouraud să fie acoperite cu bumbac și nu cu capac cu șurub, deoarece s-a demonstrat că condițiile semi-anaerobe inhibă formarea sporilor la unele tulpini, de exemplu Coccidioides immitis. De asemenea, majoritatea ciupercilor sunt aerobe.

În cazul utilizării capacului cu șurub, nu închideți ermetic.

QA

Mediile pregătite trebuie să fie supuse controlului calității pentru a-și verifica funcționarea corectă. Pentru aceasta, sunt semănate anumite tulpini de control.

Pentru agoura de dextroză Sabouraud cu cloramfenicol, se pot folosi tulpini de ATCC de Candida albicans, care trebuie să aibă o creștere excelentă. O altă placă este inoculată cu tulpini de Escherichia coli, care trebuie complet inhibate.

O placă neinoculată este, de asemenea, incubată în care nu trebuie să crească microorganisme.

Pentru agoura de dextroză Sabouraud cu cloramfenicol și cicloheximid, se pot folosi tulpini de trichophyton mentagrofite și acestea ar trebui să se dezvolte bine. O altă placă este inoculată cu o tulpină de Aspergillus flavus, în care trebuie să existe o creștere mică sau deloc. În plus, o placă neinoculată este incubată pentru a demonstra sterilitatea sa.

Pentru agoura de dextroză Sabouraud cu cicloheximid, se folosesc tulpini de Candida albicans, Trichophyton rubrum sau Microsporum canis, care trebuie să arate o creștere bună.

De asemenea, este inclusă o tulpină de Aspergillus flavus, care prezintă o creștere mică sau deloc. În cele din urmă, incubați o placă neinoculată pentru a controla sterilitatea.

Aplicații

Cultura primară

Agarul clasic de dextroză Sabouraud conține 4 grame de dextroză și este excelent ca mediu de izolare primară, deoarece arată morfologia caracteristică a fiecărei ciuperci.

Este excelent și pentru demonstrarea producției de pigmenți. Cu toate acestea, nu este cel mai bun mijloc de observare a sporulării.

De asemenea, nu este recomandat pentru cultivarea Blastomyces dermatitidis, care este inhibată de concentrația mare de glucoză prezentă.

Pe de altă parte, pentru cultivare trebuie luate în considerare anumite considerente.

Unii ciuperci cresc cel mai bine la temperatura camerei, cum ar fi mucegaiurile, alții cresc cu succes la 37 ° C, cum ar fi unele drojdii, iar altele pot crește la ambele temperaturi (ciuperci dimorfice).

Din acest motiv, uneori este necesară utilizarea mai multor plăci de agar Sabouraud pentru același eșantion, deoarece semănatul duplicat se face adesea pentru a incuba o placă la temperatura camerei și alta la 37 ° C.

De exemplu, Sporothrix schenckii este semănat în două plăci; unul este incubat la temperatura camerei pentru a obține faza de mucegai, iar celălalt este incubat la 37 ° C pentru a obține faza de drojdie, dar în cea din urmă este necesar să se adauge 5% din sânge la mediu.

În alte cazuri, cum ar fi probele de micetom, sunt însămânțate două plăci de agar Sabouraud, una cu cloramfenicol și cealaltă cu cicloheximidă. Primul va permite creșterea agenților cauzali ai micotomului de origine fungică (Eumicetom) și al doilea agenți cauzali ai micetomului de origine bacteriană, cum ar fi actinomicetomele.

Sporularea

Emoura Amoura Sabouraud Dextrose Agar conține 2 grame de dextroză și nu este folosit numai pentru izolare, ci și pentru sporulare și conservarea ciupercilor.

În acest mediu, tulpinile de Blastomyces dermatitidis pot fi recuperate.

Conservare

Pentru a păstra culturile de ciuperci, acestea pot fi păstrate la frigider (2-8 ° C). Timpul de conservare poate varia între 2 până la 8 săptămâni. După acest timp, ele trebuie subcultivate pentru a repeta procesul.

Unii ciuperci se mențin cel mai bine la temperatura camerei, cum ar fi Epidermophyton foccosum, Trichophyton schoenleinnii, T. violaceum și Microsporum audounii.

Menținerea tulpinii poate fi prelungită pentru a evita pleomorfismul dacă dextroza este îndepărtată complet din agar și dacă cantitatea de agar în mediu este redusă pentru a evita uscăciunea.

microculturi

Pentru identificarea unor ciuperci filamentoase, este necesar să se efectueze microculturi utilizând agoura Sabouraud sau alte mijloace speciale pentru a observa structurile reproducerii sexuale și asexuale.

În micologia umană

Este utilizat în principal pentru diagnosticul bolilor fungice, în special a celor care afectează pielea și atașamentele sale (păr și unghii).

Probele pot fi secreții, exudate, piele, păr, unghii, spută, LCR sau urină. Agenții patogeni frecvent izolați sunt dermatofitele, ciuperci care provoacă micoze subcutanate și sistemice.

Micologia animalelor

Animalele sunt adesea afectate de infecții fungice, de aceea, Sabouraud agar este la fel de util în micologia animalelor ca și la om.

De exemplu, dermatofitele pot afecta adesea animalele. Așa se întâmplă în cazul distorsiunii Microsporum canis var, care infectează frecvent câini, pisici, cai, porci și maimuțe. De asemenea, Microsporum gypseum infectează câinii, pisicile și animalele.

Păsările, cum ar fi puii, cocoșii și puii sunt afectați de Microsporum gallinae.

Alți ciuperci, cum ar fi Zymonema farciminosum, sunt, de asemenea, cauza bolii la animale, în principal la cai, catâri și măgari, producând o inflamație semnificativă în vasele limfatice.

Sporothrix schenkii și Histoplasma capsulatum afectează animalele domestice și oamenii.

Micologia mediului

Multe ciuperci patogene sau oportuniste se pot concentra în orice moment într-un anumit mediu, în special în sălile de operații și în Unitățile de Terapie Intensivă (UCI) ale clinicilor și spitalelor. Prin urmare, este necesar să se efectueze un control al acestora.

Alte spații vulnerabile sunt bibliotecile și clădirile vechi, care pot fi afectate de concentrarea ciupercilor de mediu.

În studiile de mediu, Sabouraud dextroză agar este utilizat pentru izolarea ciupercilor.

Micologia industrială

Agar de dextroză Sabouraud nu poate lipsi pentru studiul ciupercilor contaminante în producția de produse cosmetice, alimente, băuturi, piele, textile, printre altele.

Micologia plantelor

Plantele suferă, de asemenea, de boli cauzate de ciuperci, care afectează diferite părți ale plantei, care pot chiar încheia recolta, provocând pierderi mari în agricultură.

Referințe

1. Cuenca M, Gadea I, Martín E, Pemán J, Pontón J, Rodríguez (2006). Diagnosticul microbiologic al micozelor și studiilor de sensibilitate antifungică. Recomandări ale Societății Spaniole de Boli Infecțioase și Microbiologie Clinică. Disponibil la adresa: coesant-seimc.org
2. Laboratorul ValteK (2009). Sabouraud dextroză agar cu cicloheximidă. Disponibil pe: andinamedica.com.
3. Navarro O. (2013). Micologie veterinară. Universitatea Națională Agrară Nicaragua.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Diagnostic microbiologic Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana SA
5. Casas-Rincón G. Micologie generală. 1994. Ediția a 2-a Universitatea Centrală din Venezuela, Ediții bibliotecare. Venezuela Caracas.