DAPI (4 ', 6-DIAMIDINO-2-FENILINDOL): CARACTERISTICI, RAȚIONAMENT, UTILIZARE - CHIMIE - 2025

DAPI (4“, 6-diamidino-2-fenilindol) este un colorant de proprietate fluorescent servește ca un marker larg utilizat în arta microscopie de fluorescenta sau citometrie in flux, printre altele. Fluorescența pe care o emite este albastru strălucitor, excitația sa apare între 455-461 nm (lumină UV).

Colorantul DAPI poate trece prin membrana celulară a celulelor moarte cu mare ușurință. Poate colora și nucleele celulelor vii, dar în acest caz, concentrația acestora trebuie să fie mai mare.

Structura chimică a colorantului fluorescent DAPI. Sursa: Imagine: Fișier: DAPI.svg este o versiune vectorială a acestui fișier. Ar trebui să fie utilizat în locul acestei imagini raster atunci când nu este inferior / Richard Wheeler (Zephyris) Imagine modificată

Colorantul este capabil să acceseze ADN-ul celular pentru care are o afinitate specială, legându-se cu mare aviditate la bazele azotate adenină și timină. Din acest motiv este foarte util în unele tehnici de biologie moleculară.

Acest compus aparține grupului de coloranți indol și s-a dovedit că are o sensibilitate mai mare la ADN decât bromura de etidiu și iodura de propidiu, în special pe gelurile de agaroză.

Utilizarea acestui colorant fluorescent este foarte largă, deoarece este utilă pentru: studierea modificărilor ADN-ului în procesele apoptotice (moartea celulelor) și, prin urmare, detectarea celulelor în acest proces; pentru fotografie cu amprenta ADN (imprimare foto ADN); studierea contaminării bacteriene; sau pentru a vizualiza segmentarea nucleară.

De asemenea, a fost utilizat în studiul benzilor cromozomiale, în detectarea ADN-ului Mycoplasmas sp, în interacțiunea ADN-proteină, în colorarea și numărarea celulelor prin imunofluorescență și chiar pentru colorarea boabelor de polen maturi.

caracteristici

DAPI este abrevierea denumirii sale chimice (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol). Formula sa moleculară este C ₁₆ H ₁₅ N _5. Are o greutate moleculară de 350,3. În apropierea intervalului luminii UV (345 până la 358 nm) se produce excitația maximă a complexului DAPI-ADN, în timp ce emisia de fluorescență maximă are loc între 455-461 nm.

Acest colorant este caracterizat ca o pulbere galbenă, dar structurile marcate cu acest fluorofor emit o lumină albastră strălucitoare.

Este un compus solubil în apă, cu toate acestea, pentru a accelera dizolvarea acestuia se poate aplica o anumită căldură. Poate fi diluat cu PBS, dar nu dizolvat direct în acesta.

Odată ce colorantul este pregătit, acesta trebuie păstrat la întuneric, adică ferit de lumină, la o temperatură de 2 până la 8 ° C (frigider). În aceste condiții, colorantul este stabil mai mult de 3 săptămâni sau luni.

Dacă este protejat de lumină, dar lăsat la temperatura camerei, stabilitatea acesteia scade la 2 sau 3 săptămâni, dar expusă luminii directe, deteriorarea este foarte rapidă. Dacă doriți să stocați mult mai mult, acesta poate fi refrigerat la -20 ° C distribuit în alicote.

Bază

Această colorare se bazează pe generarea unui contrasistent nuclear în principalele tehnici de biologie moleculară, cum ar fi: citometrie de flux, microscopie fluorescentă și colorarea cromozomilor metafazei sau a nucleelor ​​interfazice, printre altele.

Această tehnică se bazează pe marea afinitate pe care colorantul o are pentru bazele azotate (adenină și timină) conținute în materialul genetic (ADN) din canalul minor. În timp ce la nivel citoplasmatic lasă foarte puține fundaluri.

Când colorantul fluorescent se leagă de regiunile adeninei și timinei de ADN, fluorescența crește semnificativ (de 20 de ori mai mult). Culoarea pe care o emite este albastru strălucitor. În special, nu există emisii de fluorescență atunci când se leagă la perechile de bază GC (guanină-citozină).

Este important de menționat că, deși are și o afinitate pentru ARN, acest lucru nu provoacă o problemă, deoarece cel mai mare grad de emisie de energie din această moleculă apare la o altă lungime de undă (500 nm), spre deosebire de ADN, care face acest lucru la 460 nm. Mai mult, creșterea fluorescenței odată legată de ARN este de doar 20%.

DAPI este utilizat mai mult pentru a colora celulele moarte (fixe) decât celulele vii, deoarece este necesară o concentrație mult mai mare a colorantului pentru a colora aceasta din urmă, deoarece membrana celulară este mult mai puțin permeabilă la DAPI când este în viață.

Colorantul DAPI poate fi utilizat în combinație cu fluoroforii roșii și verzi pentru o experiență multicoloră.

Utilizare

DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) este un fluorofor excelent și, prin urmare, este utilizat pe scară largă în diverse tehnici și în diverse scopuri. Următoarele explică utilizarea DAPI în principalele tehnici.

Citometrie în flux

Cercetătorii Gohde, Schumann și Zante au fost primii care au utilizat și au propus DAPI ca fluorofor în tehnica citometriei fluxului, având un mare succes datorită sensibilității sale ridicate la ADN și intensității mari a emisiilor de fluorescență.

Utilizarea DAPI în această tehnică permite studiul ciclului celular, cuantificarea celulelor și colorarea celulelor vii și moarte.

Deși există și alți coloranți, cum ar fi bromura de etidiu, oxidul Hoechst, portocala acridină și iodura de propidiu, DAPI este unul dintre cele mai utilizate pe scară largă, deoarece este mai fotostabil decât cele menționate anterior.

Pentru această tehnică este necesară fixarea celulelor, pentru aceasta se poate folosi etanol absolut sau 4% paraformaldehidă. Proba este centrifugată și supernatantul este aruncat, apoi celulele sunt hidratate adăugând 5 ml de tampon PBS timp de 15 minute.

În timp ce trece timpul, pregătiți colorația DAPI cu un tampon de colorare (FOXP3 de la BioLegend) la o concentrație de 3 pM.

Centrifugați proba, aruncați supernatantul și apoi acoperiți cu 1 ml soluție DAPI timp de 15 minute la temperatura camerei.

Duceți eșantionul la citometrul de curgere cu laserul adecvat

Microfluorometrie cu flux

O altă tehnică în care se folosește DAPI este în micro-fluorometria în flux împreună cu un alt fluorofor numit mitramicină. Ambele sunt utile pentru cuantificarea ADN-ului cloroplastului individual, dar DAPI este cel mai potrivit pentru măsurarea particulelor de bacteriofag T4.

Hibridizare

Această tehnică folosește practic sonde ADN marcate cu un colorant fluorescent care poate fi DAPI.

Eșantionul necesită un tratament termic pentru a denatura ADN-ul dublu-catenar și pentru a-l transforma în două catene monocatenare. Este hibridată ulterior cu o sondă de ADN denaturată marcată cu DAPI care are o secvență de interes.

Ulterior este spălat pentru a elimina ceea ce nu a fost hibridizat, un contrast este utilizat pentru vizualizarea ADN-ului. Microscopul cu fluorescență permite observarea sondei hibridizate.

Această tehnică are scopul de a detecta secvențe specifice în ADN-ul cromozomial, putând face diagnosticul anumitor boli.

Aceste tehnici cito-moleculare au fost de mare ajutor în determinarea detaliilor în studiul cariotipurilor. De exemplu, el a arătat regiunile bogate în pereche de adenozină și timină numite regiuni heterochromatice sau benzi DAPI.

Această tehnică este utilizată pe scară largă pentru studiul cromozomilor și cromatinei la plante și animale, precum și în diagnosticul patologiilor prenatale și hematologice la om.

În această tehnică, concentrația DAPI recomandată este de 150 ng / ml pentru un timp de 15 minute.

Glisierele asamblate trebuie depozitate protejate de lumină la 2-8 ° C.

Colorarea imunofluorescenței

Celulele sunt fixate cu 4% paraformaldehidă. Dacă se utilizează alte pete, DAPI este lăsat la sfârșit sub formă de rezervor și celulele sunt acoperite cu soluție PBS timp de 15 minute. În timp ce trece timpul, pregătiți soluția DAPI diluând cu PBS, astfel încât concentrația finală să fie de 300 uM.

Apoi excesul de PBS este îndepărtat și acoperit cu DAPI timp de 5 minute. Spală de mai multe ori. Diapozitivul este vizualizat sub un microscop fluorescent sub filtrul corespunzător.

Fișă de siguranță

Acest compus trebuie manipulat cu grijă, deoarece este un compus care are proprietăți mutagene. Carbonul activat este utilizat pentru a elimina acest compus din soluții apoase care trebuie aruncate.

Mănușile, halatul și ochelarii de siguranță trebuie folosiți pentru a evita accidentele cu acest reactiv. Dacă apare contactul cu pielea sau cu mucoasa, zona trebuie spălată cu suficientă apă.

Nu trebuie să pipetați niciodată acest reactiv, pe gură, să folosiți pipete.

Nu contaminați reactivul cu agenți microbieni, deoarece acest lucru va duce la rezultate eronate.

Nu diluați pata DAPI mai mult decât se recomandă, deoarece va scădea semnificativ calitatea petei.

Nu expuneți reactivul la lumină directă sau păstrați la cald deoarece acest lucru scade fluorescența.

Referințe

1. Brammer S, Toniazzo C și Poersch L. Corantes sunt implicate frecvent în citogenetica plantelor. Arq. Inst. Biol. 2015, 82. Disponibil de la: scielo.
2. Laboratoare Impath. DAPI. Disponibil la: menarinidiagnostics.com/
3. Laboratoare de citocel. 2019. Instrucțiuni de utilizare a DAPI. disponibil pe cytocell.com
4. Elosegi A, Sabater S. Concepte și tehnici în ecologia râurilor. (2009). Editorial Rubes, Spania. Disponibil la adresa: books.google.co.ve/
5. Novaes R, Penitente A, Talvani A, Natali A, Neves C, Maldonado I. Utilizarea fluorescenței într-o metodă disector modificată pentru a estima numărul de miocite în țesutul cardiac. Arh. Bras. Cardiol. 2012; 98 (3): 252-258. Disponibil de la: scielo.
6. Rojas-Martínez R, Zavaleta-Mejía E, Rivas-Valencia P. Prezența fitoplasmelor în papaya (Carica papaya) în Mexic. Revista Chapingo. Seria horticultura, 2011; 17 (1), 47-50. Disponibil pe: scielo.org.