BIURET: RAȚIONAMENT, REACTIVI, PROCEDURĂ, UTILIZĂRI - BIOLOGIE - 2025

Biuretul este un reactiv utilizat pentru determinarea proteinelor cu catenă lungă și catenă scurtă. Este utilizat în special în domeniul chimiei analitice și al analizei urinare pentru a investiga concentrația proteinelor totale în ser, plasmă și urină.

Valorile proteinelor pot fi crescute sau diminuate în anumite patologii. Simptomele hipoproteinemiei apar de obicei la pacienții cu boală renală, la pacienții subnutriți și la pacienții cu infecții cronice.

Structura chimică a complexului format în testul Biuret pozitiv al reacției Biuret. Sursa: Yikrazuul / flickr

În timp ce hiperproteinemia este observată în patologii precum mielom multiplu, lupus eritematos sistemic, endocardită bacteriană, meningită bacteriană, macroglobulinemia Waldenstrom, printre altele.

Pe de altă parte, prezența proteinei în urină se datorează filtrării albuminei de către rinichi. Acesta este un comportament patologic care trebuie studiat.

În acest sens, Biuret este foarte util, deoarece permite cuantificarea prezenței proteinelor în ser, plasmă, urină, printre multe alte probe.

Chiar și Biuret poate fi utilizat pentru a investiga prezența și concentrarea proteinelor în eșantioane slab explorate sau probe de compoziție necunoscută. Prin urmare, este utilizat pe scară largă în zona de cercetare.

Testul Biuret se bazează pe detectarea legăturilor peptidice. Testul are loc într-un mediu alcalin. Eșantionul trebuie să conțină cel puțin două legături peptidice pentru a se forma un complex violet-violet. Complexul este format din unirea legăturilor și a ionului de cupru.

Bază

Reactivul Biuret este compus din hidroxid de potasiu, sulfat cupric și tartrat de sodiu și potasiu. Hidroxidul de sodiu este utilizat pentru alcalinizarea mediului, deoarece această condiție este esențială pentru a avea loc reacția.

Substanțele care reacționează cu proteinele sunt sulfatul cupric, în timp ce tartratul de sodiu are funcția de a nu permite formarea hidroxidului de cupru, care tinde să precipite și să interfereze cu reacția.

Dacă în eșantion se găsesc substanțe cu legături peptidice (polipeptide sau proteine), testul va fi pozitiv.

O reacție este interpretată ca fiind pozitivă când soluția devine violet. Culoarea este produsă prin formarea unui complex între cel puțin două legături peptidice care au grupa CO-NH și cationii cuprici.

Complexul violet poate fi format în două moduri: unul este prin pierderea protonilor din grupele amide care se leagă de metal (depronotare), iar celălalt prin unirea electronilor de oxigen și azot care sunt liberi și se leagă cu cupru.

Această reacție poate varia ca intensitate și culoare, în funcție de tipul de proteine.

Testul poate fi efectuat calitativ sau cantitativ. În forma calitativă este raportat ca fiind pozitiv sau negativ. În timp ce în forma cantitativă, concentrația poate fi măsurată prin metoda spectrofotometrică.

Reacția este citită între 540-560 nm. Intensitatea culorii este direct proporțională cu concentrația legăturilor peptidice din probă.

Reactivi

-20% hidroxid de sodiu (NaOH)

-Pentahidrat de sulfat de cupru 1% (CuSO _4. 5H ₂ O)

-Tetrahidrat de sodiu și tartrat de potasiu amestecat (KNaC ₄ H ₄ O ₆ · 4H ₂ O)

Stabilitatea reactivului Biuret

-Trebuie păstrat la frigider.

Proces

Tehnică

-Așezați 100 ul de probă sau etalon pentru a fi analizate într-o eprubetă.

-Adăugați 2 ml de hidroxid de sodiu.

-Mix foarte bine.

-Adăugați 5 ml de reactiv Biuret.

-Mestecați și lăsați să se odihnească 25 de minute la temperatura camerei, acoperiți și protejați-vă de lumină.

-Să păstreze sau nu formarea culorii și măsoară spectrofotometric.

Curba de calibrare

Albumină serică bovină poate fi utilizată ca standard pentru a efectua curba de calibrare. Din aceasta sunt preparate diverse concentrații. De exemplu 25, 50, 75, 100, 125 și 150%.

Reacția este configurată cu toate aceste concentrații cunoscute și absorbția este citită la o lungime de undă de 540 nm. Cu datele concentrațiilor cunoscute și citirile de absorbție se face curba de calibrare.

În fiecare determinare sau lot de eșantioane procesate, se recomandă montarea unui standard. Albumină serică bovină 0,1-2 mg / ml poate fi utilizată ca standard de calibrare.

Măsurătorile se fac pe un spectrofotometru la 540 nm.

Linearitatea este atinsă până la o concentrație de 12 g / dl.

imixtiune

Substanțe care interferează cu testul Biuret

Deși nu este foarte frecvent, trebuie remarcat faptul că unele substanțe pot interfera în timpul executării acestui test. De exemplu, prezența amoniacului poate inhiba formarea culorii.

De asemenea, alte substanțe ar putea absorbi la aceeași lungime de undă, cum ar fi anumiți pigmenți.

Pe de altă parte, interferența poate fi generată atunci când o altă substanță decât legătura peptidică formează un complex cu sarea cuprică. Exemplu: unii carbohidrați și anumite lipide.

În cazul în care eșantionul de analizat prezintă un tip de precipitat, acesta trebuie filtrat sau centrifugat înainte de montarea testului.

Substanțe care nu interferează cu testul Biuret

Testul nu este afectat de prezența:

-Bilirubină până la o concentrație de 20 mg / dl.

-Hemoglobina până la o concentrație de 750 mg / dl.

-Dextran până la o concentrație de 30 g / L.

-Trigliceride până la o concentrație de 4000 mg / dl.

Avantaj

-Este o metodă simplă de executat.

-Este un test economic.

-Are specificitate ridicată pentru proteine.

-Preferă interferența.

Dezavantaje

Are o sensibilitate slabă pentru a detecta cantități mici de proteine. Lucrările efectuate de Fuentes și colab. Afirmă că metoda de testare Biuret are o limită de detecție de 1 mg / ml proteină și o limită de cuantificare de 3 mg / ml.

Cu toate acestea, alte cercetări efectuate la Universitatea din Amazonia raportează valori mult mai mici. Limita de detecție raportată de studiu este de 0,020 mg / ml, iar limita de cuantificare este de 1,33 mg / ml.

Aplicații

Reactivul sau testul Biuret este utilizat pentru determinarea proteinelor în probele clinice și nonclinice în laboratoarele de rutină și de cercetare.

Patologii care apar odată cu creșterea sau scăderea nivelului

În multe patologii este important să se determine concentrația proteinelor totale în probele clinice, care poate fi crescută sau diminuată.

Ele sunt crescute în:

-Mielom multiplu,

-Lupus eritematos sistemic,

-Endocardită bacteriană,

-Meningită bacteriană,

Macroglobulinemia Waldenstrom, printre altele.

Se scade în:

-Insuficiență renală,

-Persoanele cu grade severe de malnutriție,

-Patienți cu infecții cronice, printre altele.

Probele clinice

Cele mai frecvente probe clinice sunt serul, plasma și urina. Valoarea normală a proteinelor din ser sau plasmă este de 6,0-8,8 gr / dl.

Concentrația proteinelor din urină la adulți nu depășește cifra de 150 mg / 24 ore.

Valoarea normală a raportului proteină / creatinăină din urină

Sugari: <0,50 mg

Copii de 2 ani și mai mari: indicele: 0,20 mg

Adulți: <0,2 mg

Eșantioane non-clinice

Reacția Biuret poate fi utilizată pentru multe tipuri de probe non-clinice, cum ar fi produse lactate, antivenom sau orice substanță necunoscută pentru care doriți să investigați prezența proteinelor.

Referințe

1. Vázquez J, Guerra L, Quintana J, Ramírez J, Fernando Ry Vázquez Y. (2014). Caracterizarea fizico-chimică și conținutul proteic al extractelor fluide din stridia de mangrove (Crassostrearizophorae). Cuban Journal of Chemistry, 26 (1), 66-74. Preluat pe 26 iunie 2019, de pe http: //scielo.sld
2. Chaparro S, Lara A, Sandoval A, Sosa S, Martínez J, Gil J. Caracterizarea funcțională a migdalului semințelor de mango (Mangifera indica L.) Revista Ciencia en Desarrollo. 2015; 6 (1): 67-75
3. „Biuretul.“ Wikipedia, enciclopedia gratuită. 19 iunie 2019, ora 16:37 UTC. 26 Iun 2019, 22:18
4. Fuentes F, Quispe I, García J. Standardizarea metodei Biuret pentru a cuantifica proteinele totale în serul polivalent antibotrop, produs la Centrul Național pentru Produse Biologice INS. Bol - Inst Nac Salud 2012; 18 (11-12). Disponibil la adresa: repositorio.ins.gob.pe
5. Laboratoare Winer Proteine ​​totale. Metoda colorimetrică pentru determinarea proteinelor totale în ser și plasmă. Disponibil la adresa: wiener-lab.com.ar