TEST DE OXIDAZA: JUSTIFICARE, PROCEDURĂ ȘI UTILIZĂRI - BIOLOGIE - 2025

Testul oxidazei este o metodă de diagnostic care arată prezența complexului enzimatic numit citocrom oxidaza c. Acest sistem induce transformarea citocromului redus în oxidat, deoarece captează oxigen și, la rândul său, acționează ca ultimul acceptor de electroni (H ⁺ ) în lanțul respirator.

Termenul oxidază este un mod scurt de referire la enzima citocrom oxidaza, cunoscută și sub denumirea de indofenol oxidază. În antichitate se credea că enzimele citocrom oxidazei și indofenol oxidazei erau două enzime diferite, dar astăzi se știe că sunt aceleași.

Test pozitiv și negativ de oxidaza. Sursa: Nu este furnizat niciun autor care poate fi citit de mașină. Alpha.prim ~ commonswiki asumate (bazate pe revendicări de copyright).

La rândul lor, citocromele sunt hemoproteine ​​care conțin fier și completează sistemul citocrom oxidazei. Citocromii pot varia de la specii la specii.

Există diferite varietăți de citocromuri (citocromele a1, a2, a3 și 0). Unele bacterii pot produce doar una, dar altele până la două sau trei simultan. În acest sens, prezența citocromului a și a3 este cunoscută sub numele de citocrom oxidază c. Acesta este tipul de citocrom pe care îl detectează testul oxidazei.

Genurile Neisseria și Pseudomonas conțin citocrom oxidază c. Aceste genuri dau testul oxidazei pozitive, contribuind la diferențierea acestora de genurile Acinetobacter și respectiv Stenotrophomonas.

Există și alte genuri care sunt oxidază pozitive.

Bază

Caracteristicile sistemului citocrom oxidazei c

Sistemul citocrom oxidazei c funcționează în felul următor: microorganismele pozitive cu oxidaza utilizează oxigenul pentru a genera energie prin respirația aerobă. Acest sistem funcționează datorită transportului electronilor de la substanțe donatoare, cum ar fi NADH ⁺ la substanțe receptoare, în acest caz oxigen.

Aceasta are ca rezultat producerea de energie (ATP) și apă sau peroxid de hidrogen, în funcție de sistemul citocrom oxidazei pe care îl posedă microorganismul.

Acesta este motivul pentru care majoritatea bacteriilor pozitive oxidazice sunt de asemenea catalaz pozitive, o condiție necesară pentru a elimina peroxidul de hidrogen produs, deoarece această substanță este toxică pentru bacterii.

Sistemul citocrom oxidazei c este prezent în unele bacterii aerobe, unele anaerobe facultative, puține microaerofile și fără anaerobe stricte. Acesta din urmă este de înțeles, deoarece anaerobii stricți nu pot trăi în prezența oxigenului, prin urmare le lipsește sistemul citocrom oxidazei.

Principiul testului

În acest test folosește substanțe care acționează ca acceptori artificiali de electroni, înlocuindu-i pe cei naturali din lanțul de transport al electronilor.

În principal, sunt folosiți coloranți precum parafenilendiamina și indofenolul, care acționează ca substraturi receptori și donatori de electroni artificiali.

Parafenilendiamina este oxidată de sistemul citocrom oxidazei c. Colorantul în forma redusă este incolor, dar în forma oxidată este colorat.

Astfel se evidențiază prezența sistemului citocrom oxidazei c; deoarece o reacție pozitivă va genera o lavandă sau o culoare albastru-purpuriu în funcție de reactivul utilizat.

Pe de altă parte, dacă ultima substanță care acceptă electroni în lanțul respirator este diferită de oxigen, testul oxidazei va fi negativ (nu există producție de culoare); acesta este cazul microorganismelor anaerobe.

De asemenea, dacă citocromul utilizat de microorganism este diferit de citocrom oxidaza c, va da și testul negativ.

Proces

Există diferiți reactivi și protocoale pentru testul oxidazei, toate în același scop.

Reactivi

Reactivul Kovacs, reactivul Gordon și McLeod, reactivul Nadi, reactivul Carpenter, Suhrland și Morrison și utilizarea discurilor oxidaza.

-Reactiv Kovacs oxidază

Este format din 1% dihidroclorură de tetrametil-p-fenilendiamină.

Reactivul Kovacs este preparat prin dizolvarea a 1 g de substanță menționată mai sus în 50 ml de apă distilată. Se încălzește subtil până se dizolvă complet. Transferați într-o sticlă de chihlimbar de capacitate suficientă și completați volumul la 100 ml cu apă distilată. Așteptați cel puțin 15 minute înainte de utilizare. Depozitați într-un frigider protejat de lumină.

Este etichetat reactiv Kovacs oxidază, pentru a-l diferenția de reactivul Kovacs utilizat pentru a dezvălui testul indol. Acest reactiv este cel mai sensibil, mai puțin toxic, dar mai scump decât restul reactivilor.

O reacție pozitivă va fi evidențiată cu acest reactiv, odată cu schimbarea culorii culorii la lavandă, care se transformă rapid în purpuriu aproape negru. O reacție negativă este evidentă, deoarece nu există nicio schimbare de culoare în colonie sau are o culoare roșie ușoară. Mediul se poate întuneca și el, dar asta nu înseamnă o reacție pozitivă.

Cu acest reactiv, timpul de reacție este crucial, o schimbare de culoare care are loc între 5 până la 15 secunde este considerată o reacție pozitivă.

-Ragentul Gordon și McLeod

Este alcătuit din dihidroclorură de dimetil-p-fenilendiamină, cunoscută și sub denumirea de N-dimetil-p-fenilendiamină sau mono-clorhidrat de p-aminodimetilanilină. Este preparat așa cum este descris pentru reactivul Kovacs oxidazei, înlocuind substanța implicată.

Acest reactiv este puțin mai stabil decât reactivul Kovacs oxidazei, deși toți reactivii care conțin p-fenilendiamină sunt instabili.

Această reacție este mai târziu, este interpretată ca fiind pozitivă cu aspectul unei culori albastru-violet în decurs de 10-30 de minute.

-Reactiv reactiv

Este compus din 1% α-naftol în alcool etilic (95% etanol) și 1% aminodimetilanilină. Amestecul este preparat în părți egale și folosind alcool etilic absolut ca diluant, până la o cantitate suficientă pentru 100 ml.

-Ragentul carpinter, Suhrland și Morrison

Este compus din 1% oxalat de p-aminodimetilalanină. Pregătiți în același mod descris pentru reactivul Kovacs oxidazei, schimbând substanța corespunzătoare.

Cu soluția gata, benzile de testare sunt preparate după cum urmează: benzi de hârtie de filtru Whatman nr. 1 sunt impregnate cu 1% reactiv de oxalat de dimetil-p-fenilendiamină.

Acestea se lasă să se usuce fără contact cu metalul, se depozitează în borcane cu șuruburi cu desicant și se păstrează în frigider. Aceste benzi sunt stabile până la 6 luni.

Este cel mai stabil reactiv dintre cei menționați și poate dura până la 6 luni în soluție. Un alt punct în plus este că nu colorează mediul din jurul coloniei, dacă este utilizat direct pe farfurie.

Aspectul unei culori roșii este interpretat ca un test pozitiv.

-Discuri de oxidaza

Sunt discuri comerciale care sunt impregnate cu reactiv pentru testul oxidazei. Există mai multe mărci comerciale pe piață.

Utilizarea sa este destul de practică, deoarece nu este necesar să se pregătească reactivi proaspeți, ceea ce facilitează munca. Rezultatele obținute sunt fiabile atât timp cât discurile sunt păstrate în mod corespunzător.

Protocoale

Metoda directă a plăcii, metoda indirectă pe hârtie și utilizarea discurilor impregnate cu reactivi oxidaza.

-Metodă directă

2 sau 3 picături din oricare dintre reactivii menționați sunt adăugați în acest scop direct pe colonia (coloanele) conținută într-o placă de mediu de cultură care nu conține glucoză.

Schimbarea sau nu a culorii coloniilor este interpretată, nu a mediului. Timpul de reacție valabil depinde de reactivul utilizat.

-Metoda indirectă pe hârtie

Tăiați o bucată de hârtie de filtru (Whatman nr. 1) la o dimensiune de 6 cm ² și așezați-o în interiorul unui vas Petri gol.

Adăugați 2 sau 3 picături de reactiv Kovacs oxidază pe hârtie, luați o parte din colonie pentru a fi studiată cu un mâner de platină sau o scobitoare din lemn și întindeți-o în linie dreaptă pe hârtia impregnată cu reactiv. Interpretați în 5 până la 10 secunde.

Cu fâșiile pregătite cu reactivul Carpenter, Suhrland și Morrison, se întinde o colonie pe banda uscată. O singură bandă este utilizată pentru a testa mai multe tulpini. Interpretați în 10 sec.

-Boane (m.)

Umectați discurile comerciale cu apă distilată sterilă și suprapuneți colonia care urmează să fie studiată. Se recomandă utilizarea plăcilor la 35 ° C, dacă se utilizează plăci la temperatura camerei sau plăci refrigerate, reacția este puțin mai lentă. Interpretați schimbarea culorii între 10 și 20 sec.

Se pot folosi colonii conținute pe sânge sau agar de ciocolată.

-Disks (metodă indirectă)

Udați discul așa cum s-a descris anterior. Puneți-l într-un vas Petri gol. Luați o cantitate suficientă de colonie pentru a studia cu un mâner de platină sau o scobitoare din lemn și așezați pe disc. Interpretați schimbarea culorii între 10 și 20 sec.

Utilizare

Genul Neisseria și Acinetobacter sunt uneori foarte asemănăți morfologic deoarece, deși genul Acinetobacter este o tijă Gram-negativă, poate uneori să ia o formă coccoidă și să fie distribuită în perechi, simulând genul Neisseria.

În acest caz, testul oxidazei este foarte util. Genul Neisseria este pozitiv și Acinetobacter negativ.

Cu toate acestea, genul Moraxella este foarte similar cu genul Neisseria și ambele dau o reacție pozitivă; Acesta este motivul pentru care testele de fermentare a carbohidraților trebuie întotdeauna efectuate pentru identificarea definitivă.

Pe de altă parte, testul oxidazei este util pentru a diferenția o bacterie aparținând familiei Enterobacteriaceae (toate oxidazele negative) de alte fermentatoare, precum genul Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas (oxidază pozitivă).

Genul Vibrio și Helicobacter sunt, de asemenea, pozitive pentru oxidază.

QA

Utilizați tulpinile cunoscute de Escherichia coli ca un control negativ și tulpinile de Pseudomonas aeruginosa ca un control pozitiv.

limitări

-Reactivii trebuie folosiți proaspăt, durata de valabilitate a acestora în soluție la temperatura camerei este scurtă, deoarece sunt foarte instabili. La frigider, acestea pot dura între 5 zile și 2 săptămâni.

-Reactivii sunt incolori, dacă își schimbă culoarea trebuie aruncați. Discurile deteriorate apar pentru că se întunecă în timp.

-Reacția pozitivă cu reactivul Kovacs oxidazei între 15-60 sec este considerată o reacție întârziată și după 60 de secunde ar trebui considerată negativă.

-Haemophylus influenzae produce o reacție de oxidază negativă dacă se folosește orice reactiv cu dimetil-p-fenilendiamina, dar pozitiv dacă se folosește reactivul Kovacs oxidazei (tetrametil-p-fenilendiamina).

-Mediile care conțin glucoză interferează cu testul, dând falsuri negative.

-Tretinele de cordet pertussis pot da o reacție falsă pozitivă dacă provin din plăci de agar de sânge foarte concentrate.

-Utilizarea mânerelor din metal (fier) ​​dă o reacție falsă pozitivă.

recomandări

-Pentru că reactivii sunt foarte instabili și tind să se auto-oxideze, se recomandă înghețarea alicotelor de 1 până la 2 ml și îndepărtarea după caz.

-Un alt mod de a întârzia auto-oxidarea reactivului este să adăugați 0,1% acid ascorbic la prepararea reactivilor.

-Deoarece reactivii sunt instabili, se recomandă un control de calitate săptămânal.

-Reagenții care nu trec testul de control al calității nu trebuie folosiți.

Referințe

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosticul microbiologic. 5 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnostic microbiologic Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
3. „Test de oxidază”. Wikipedia, enciclopedia gratuită. 15 ianuarie 2018, 10:32 UTC. 3 Apr 2019, 14:03
4. Organizația Mondială a Sănătății. Manual de laborator pentru identificarea și testarea susceptibilității la antimicrobiene a agenților patogeni bacterieni cu importanță în sănătatea publică în lumea în curs de dezvoltare. 2004. Disponibil la adresa: who.int/drugresistance/infosharing
5. Benzi de reactivi pentru diagnosticul activității oxidazei la bacterii. Rev Cubana Med Trop. 2000; 52 (2): 150-151.