TEST CATALASE: RAȚIUNE, TEHNICĂ ȘI UTILIZĂRI - BIOLOGIE - 2025

Testul catalazei este o metodologie utilizată în laboratoarele de bacteriologie pentru a dezvălui prezența enzimei catalază la acele bacterii care o posedă. Împreună cu colorația Gram, acestea sunt principalele teste care trebuie efectuate pe microorganisme nou izolate. Aceste teste îndrumă microbiologul asupra etapelor de urmat pentru identificarea definitivă a microorganismului în cauză.

În general, bacteriile care conțin citocrom posedă enzima catalază, ceea ce înseamnă că bacteriile aerobe și anaerobe facultative ar trebui să o posede. Cu toate acestea, există excepții, cum ar fi Streptococcus, care, deși sunt microorganisme anaerobe facultative, nu posedă enzima catalază.

Derularea testului Catalase, care arată o reacție pozitivă. Sursa: Nu este furnizat niciun autor care poate fi citit de mașină. Nase asumat (bazat pe revendicări de copyright).

Acesta este motivul pentru care testul catalazei este utilizat în principal pentru a distinge familiile Staphylococaceae și Micrococaceae (ambele catalaz pozitive) de familia Streptococaceae (catalază negativă).

De asemenea, genul Bacillus (catalază pozitivă) se distinge de genul Clostridium (catalază negativă), printre altele.

Bază

Catalaza este o enzimă clasificată ca hidroperoxidazică, acest lucru înseamnă că ele utilizează peroxid de hidrogen (H ₂ O ₂ ) ca substrat .

De asemenea, este considerată o oxidoreductază, deoarece în reacția la care participă există un element care servește ca donator de electroni (substanță reducătoare) și altul ca receptor de electroni (substanță oxidantă).

Catalază este o proteină care conține o grupare proserică cu patru atomi de fier trivalenți (Fe ⁺⁺⁺ ), prin urmare este o homoproteină. Ionul feric rămâne oxidat în timpul reacției.

Se poate spune că catalază este o enzimă detoxifiantă, deoarece funcția sa este de a elimina substanțele produse în timpul metabolismului bacterian care sunt toxice pentru bacterii. Printre aceste substanțe este peroxidul de hidrogen.

Peroxidul de hidrogen se formează din descompunerea aerobică a zaharurilor. Acest proces are loc după cum urmează:

Ionul de superoxid (O ₂ ^- ) (radicalul liber) este format ca produs final al asimilării glucozei pe calea aerobă. Acesta este toxic și este eliminat de enzima superoxid dismutaza care o transformă în oxigen gazos și peroxid de hidrogen.

Peroxidul de hidrogen este, de asemenea, toxic pentru bacterii și trebuie eliminat. Enzima catalază descompune peroxidul de hidrogen în apă și oxigen.

Catalasa poate acționa asupra altor substraturi decât peroxidul de hidrogen, cum ar fi alcooli, aldehide, acizi, amine aromatice și fenoli. Cu toate acestea, peroxidul de hidrogen poate fi utilizat și de catalază pentru oxidarea altor compuși toxici, cum ar fi alcoolul etilic și etilic.

De asemenea, catalază este prezentă în celulele fagocitice, protejându-l de acțiunea toxică a peroxidului de hidrogen.

Tehnica de rutină pentru testul Catalase

-Metoda de glisare

materiale

3% peroxid de hidrogen (10 volume).

Diapozitiv pentru microscop

Mâner de plastic de unică folosință sau scobitoare din lemn.

Proces

Profitați destul de mult din colonie pentru a studia fără a atinge agarul din care a provenit. Colonia trebuie să fie proaspătă, adică dintr-o cultură de 18 până la 24 de ore.

Se plasează colonia pe diapozitiv uscat și se adaugă o picătură de peroxid de hidrogen 3% la ea ( 30% H ₂ O ₂ poate fi de asemenea utilizat ). Observă imediat dacă sunt eliberate sau nu bule.

Interpretare

Reacție pozitivă: evoluția gazelor, evidențiată prin formarea de bule (bule puternice).

Reacție negativă: nu se formează bule.

-Metoda directă în cultura pură

Plasați 1 ml H ₂ O _2% pe o placă pură sau o cultură de pană care nu conține sânge (de preferință agar nutritiv). Observă dacă există sau nu formarea de bule imediat. 30% H ₂ O ₂ poate fi de asemenea utilizat .

Este interpretat la fel ca metoda obiectului porta.

-Metod cu tub capilar sau Fung și Petrishko

Umpleți un tub capilar de 67 mm până la o înălțime de 20 mm cu peroxid de hidrogen 3% prin capilaritate.

Atingeți colonia izolată care trebuie studiate cu capilar umplut cu 3% H ₂ O _{2 .} Observați dacă capilarul se umple cu bule în aproximativ 10 secunde. Această metodă permite semi-cuantificarea reacției în încrucișări:

Fără cruci nu există bule (reacție negativă).

+ ---- Puține bule (reacție slabă sau întârziată).

++ --– Bulele abundente (reacție moderată).

+++ - Butoanele ajung la capătul opus (reacție puternică).

-Metoda de tip Tachlor și Achanzar pentru teste de catalază care dau îndoială

Așezați o colonie izolată pe o lamelă curată și uscată, apoi puneți o picătură de 0,5% H ₂ O ₂ și acoperiți cu o copertă. Observă dacă există sau nu formarea de bule prinse.

Interpretare: prezența bulelor indică o reacție pozitivă. Fără bule, este interpretat ca o reacție negativă.

Test de catalază pentru specia Mycobacterium

Această tehnică trebuie făcută prin controlul pH-ului și al temperaturii. Trebuie efectuat sub o capotă cu flux laminar, deoarece manipularea diferitelor specii Mycobacterium este periculoasă.

-materiale

Peroxid de hidrogen 30% sau 110 volume (superoxal).

Tampon fosfat pH 7

10% Tween 80

Cultura cu pană micobacterium timp de 3 până la 4 săptămâni

-Pregatirea

Tampon fosfat pH 7

A cantari:

1.361 g de fosfat monopotasic anhidru (KH ₂ PO ₄ ).

1.420 g fosfat disodiu anhidru (Na2HPO3).

Se dizolvă ambele săruri într-o apă distilată puțin sterilă și se completează până la 1000 ml cu apă.

10% Tween 80

Faceți o diluție de 1:10 la Tween 80 care este concentrat comercial, pentru a face acest lucru după cum urmează:

Luați 1 ml de Tween 80 și așezați-l într-un pic de apă distilată, dizolvați și apoi completați volumul cu apă la 10 ml.

Reactiv final

Se amestecă o cantitate de tampon fosfat cu o cantitate de 10% Tween 80 (părți egale). Definiți în laborator cât doriți să pregătiți.

-Proces

Puneți 5 ml de tampon fosfat într-o epruvetă sterilă (Bakelite).

Cu o buclă de inoculare, luați o cantitate suficientă de creștere Mycobacterium însămânțată în pană și dizolvați în tamponul de fosfați.

Acoperiți tubul fără a strânge prea mult firul. Se introduce într-o baie de apă la 68 ° C timp de 20 până la 30 de minute. Scoateți și lăsați să se răcească la 22-25 ° C

Măsurați 0,5 ml de reactiv final (amestec) și adăugați-l în tub cu soluția rece. Observați formarea sau nu de bule.

Se interpretează la fel ca tehnicile anterioare.

Utilizare

Când creșterea coloniei este obținută în medii îmbogățite, trebuie efectuată o colorare de Gram și un test de catalază pe coloniile obținute. Acest lucru va ghida microbiologul asupra procedurilor de urmat pentru identificarea definitivă.

Sursa: Pregătit de autor MSc. Marielsa gil

QA

Pentru a evalua performanța bună a reactivului de peroxid de hidrogen, folosiți tulpini de control proaspăt cultivate, cum ar fi Staphylococcus aureus ca un control pozitiv și tulpinile Streptococcus sp ca un control negativ.

O altă alternativă care servește ca un control pozitiv este de a plasa o picătură de peroxid de hidrogen pe agarul din sânge, eritrocitele au catalază, prin urmare, va exista o balonare dacă reactivul este în stare bună.

Un agar de ciocolată poate fi utilizat ca un control negativ, aici eritrocitele sunt deja lizate, iar testul este negativ.

limitări

-Nu folosiți culturi vechi pentru test, deoarece acest lucru poate provoca falsuri negative.

-Evitati sa luati colonii din culturi pe agar de sange, daca aveti grija sa nu atingeti agarul; Această procedură poate duce la falsuri pozitive, deoarece globulele roșii conțin catalază.

-Dacă luați colonia cu un mâner de platină, nu inversați ordinea procedurii, deoarece acest lucru poate genera falsuri pozitive. Acest lucru se datorează faptului că platina este capabilă să reacționeze cu peroxidul de hidrogen, provocând o bubitură.

-Nu folosiți reactivul peroxid de hidrogen dacă este foarte vechi, deoarece reactivul este foarte instabil și tinde să se descompună în timp.

-Păstrați reactivul de peroxid de hidrogen protejat de lumină și refrigerat pentru a preveni deteriorarea.

-Performați un control al calității reactivului de peroxid de hidrogen de fiecare dată când este utilizat.

-Ia în considerare faptul că , dacă 30% H ₂ O ₂ este utilizată, reacțiile sunt mai puternice decât cele realizate cu 3% H ₂ O ₂ .

Referințe

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosticul microbiologic. 5 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnostic microbiologic Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
3. Mac Faddin J. (2003). Teste biochimice pentru identificarea bacteriilor de importanță clinică. 3. ed. Editorial Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
4. Laboratoare BD. Reactiv Catalase-Gotario. Disponibil la: http://winklerltda.cl
5. Laboratoarele Vadequímica Peroxid. Echivalența între volume și procente. Disponibil la adresa: vadequimica.com