PROTEINAZA K: CARACTERISTICI, ACTIVITATE ENZIMATICĂ, APLICAȚII - BIOLOGIE - 2025

Proteinaza K este o enzimă care aparține grupului de serin proteaze, adică, are într - o mediană serina de aminoacizi activă catalitic și are funcția de a rupe legăturile peptidice prin hidroliză. La rândul său, această enzimă aparține familiei proteinelor subtilisinice (peptidaza S8).

Proteinaza K are o greutate moleculară (MW) de 28.900 daltoni și a fost izolată pentru prima dată în 1974 în extracte din albumul ciupercii Engyodontium, cunoscut anterior ca albumul Tritirachium Limber.

Structura moleculară a proteinazei K. Sursa: Lykchiniadis

Are o capacitate proteolitică ridicată, demonstrată prin faptul că poate degrada cheratina prezentă în păr. Cuvântul cheratină în engleză este scris „keratină”, de aceea a fost denumit „proteinază K”.

Datorită puterii sale mari de scindare a proteinelor native, această enzimă este utilă în diferite tehnici de biologie moleculară. Este folosit în principal pentru izolarea și prepararea acizilor nucleici cu greutate moleculară mare (MW).

Proteinaza K funcționează prin eliberarea ADN-ului nuclear, în timp ce distruge proteinele și inactivează RNazele și DNazele, adică elimină nucleazele din preparatele ADN și ARN.

Pe de altă parte, s-a văzut că proteinaza K poate hidroliza unele proteine ​​native denaturate, ceea ce a trezit interesul cercetătorilor pentru utilizarea sa în studiul proteinelor prionice (PrPC).

Cu toate acestea, în ciuda potenței lor proteolitice ridicate, există proteine ​​rezistente la acțiunea proteinazei K. Printre ele se numără câteva proteine ​​anormale numite prioni (PrPSc), asociate cu encefalopatii spongiforme transmisibile.

Caracteristicile proteinazei K

Proteinaza K are o structură terțiară formată din trei straturi, cu o foaie de șapte lanțuri interpuse între două straturi de elice. Deoarece aparține familiei de peptidaze S8, aceasta se caracterizează prin faptul că are o triadă catalitică în situsul său activ, a cărei ordine secvențială este (Asp, His și Ser), care le diferențiază de alte familii de peptidase.

Această enzimă din grupul serin proteazelor se caracterizează prin hidrolizarea legăturilor peptidice apropiate de grupul carboxilic de aminoacizi alifatici și aromatici.

Pe de altă parte, este capabil să acționeze în prezența anumitor substanțe corozive, cum ar fi sulfat de sodiu dodecil (SDS), Tris-HCL și EDTA, care sunt utilizate pentru a ajuta la denaturarea proteinelor, determinându-le să-și piardă structura natală.

Acesta este un pas preliminar în prepararea proteinelor pentru tehnica electroforezei. Intervalul de pH la care acționează proteina K este destul de larg (2,0 până la 12,0), cu un pH optim între 7,5 și 12,0, iar punctul său izoelectric este 8,9. După cum se poate observa, este activ împotriva unui interval de pH foarte larg.

O altă caracteristică care se evidențiază în proteina K este stabilitatea sa în prezența temperaturilor ridicate (50 - 60 ° C).

Activitate enzimatică

Proteinaza K necesită prezența ionului de calciu, deși acest lucru nu afectează activitatea acestuia, dacă este esențial pentru menținerea stabilității sale.

Pentru ca proteinasa K să digere complet substratul, este necesar un timp de contact de aproximativ 5 minute până la 2 ore.

Cu toate acestea, în acest sens, Daza și colab. Au comparat puritatea ADN-ului obținut în diferite momente de expunere la proteinază K și au ajuns la concluzia că o incubare prelungită (până la 24 de ore) îmbunătățește semnificativ calitatea ADN-ului.

Cu toate acestea, în raport cu concentrația enzimei proteinazei K utilizate în diferitele protocoale, se poate spune că este foarte variată.

Poate fi utilizat de la concentrații foarte mici (5 pg / ml) până la concentrații de 500 pg / ml. Dar cele mai frecvente concentrații de lucru variază între 50 și 100μg / ml, în special pentru digestia proteinelor și inactivarea nucleazei. Deși pentru tratamentul țesuturilor este necesară o concentrație de 2 mg / ml.

Aplicații

Aplicațiile sale sunt foarte largi și pot fi rezumate după cum urmează:

-Este utilizat în digestia proteinelor și extragerea ADN-ului prin diferite metode, cum ar fi: sărare, PK-SDS, bromură de cetil-trimetil amoniu (CTAB), acetat de potasiu modificat și extracție cu iodură de sodiu.

-Inactivarea nucleazelor (RNaze și DNaze).

-In tehnica de hibridizare in situ (HIS), pentru a ajuta eliberarea acidului nucleic, pe lângă eliminarea proteinelor nedorite.

-Modificarea proteinelor.

-La nivel de cercetare, în diferite studii.

Avantajele proteinazei K

S-au efectuat mai multe studii comparative între tehnicile de extracție a ADN-ului care utilizează proteinaza K, cu altele care nu o folosesc și toate concluzionează că există beneficii mai mari atunci când se folosește enzima. Avantajele includ următoarele:

-DNA cu greutate moleculară mare, de înaltă calitate și puritate.

-ADN-ul extras este stabil până la 3 luni.

ADN-ul extras poate fi utilizat în următoarele tehnici: Southern blot, reacție în lanț a polimerazei (PCR), electroforeză, printre altele.

Proteinease rezistente la proteine ​​K

Diverse investigații au ajuns la concluzia că prionii (proteine ​​PrPSc anormale toxice) diferă de proteinele PrPC (native), fiind rezistente la acțiunea proteinazei K, în timp ce PrPC-urile sunt sensibile la acțiunea sa.

Alți autori au descris că în structura PrPSc există porțiuni sensibile și altele rezistente la proteinaza K. Cu toate acestea, ambele părți sunt la fel de toxice și infecțioase.

Pe de altă parte, Bastian și colab., În 1987, au izolat 4 proteine ​​de 28, 30, 66 și 76 kda dintr-o specie de Spiroplasma mirum. Toate s-au dovedit a fi rezistente la acțiunea proteinazei K și au avut, de asemenea, o reacție încrucișată cu unii prioni.

Este cunoscut faptul că această specie poate provoca cataractă și leziuni neurologice semnificative, iar datorită descoperirilor științifice ale lui Bastian, printre alte investigații, a fost făcută o încercare de a lega acest microorganism cu encefalopatii spongiforme transmisibile.

Cu toate acestea, etiologia acestei patologii neurologice degenerative continuă să fie atribuită astăzi prionilor.

În acest sens, în 1991, Butler și colab. Au identificat și caracterizat o clasă de proteine ​​rezistente la proteinaza K de 40 kda din două tulpini de Mycoplasma hyorhinis. Acest agent patogen afectează porcii, infectându-și țesuturile, dar în acest caz nu a existat o reacție încrucișată cu prionii testați.

Sunt necesare mai multe cercetări pentru a elucida multe necunoscute în acest sens.

Referințe

1. Bastian F, Jennings R și Gardner W. 1987. Antiserumul la proteina fibrilă asociată scrapiei reacționează încrucișat cu proteinele de fibrilă Spiroplasma miru m. J. Clin. Microbiol. 25: 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, Rey J, Ruiz V. Evaluarea unei metode de extracție și purificare a ADN-ului din țesutul muscular fixat cu formaldehidă de cadavre neidentificate. Revista Med, 2014; 22 (1): 42-49,
3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E și Mcgarrity G. Identificarea și caracterizarea proteinelor rezistente la proteina K în membrii clasei Mollicutes. Infecție și imunitate, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, și colab. Comparația a două protocoale de extracție ADN Trypanosoma cruzi cultivate pe mediu axenic. Rev. Peru. Med. Exp. Sănătate Publică 2014; 31 (2): 222-227. Disponibil pe: scielo.org
5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E și Palma W. Determinarea eficienței a cinci protocoale de extracție ADN din materialul parafinat pentru studii moleculare. Rev Méd Univ Costa Rica. 2007; 1 (1): 10-19.