LÖWENSTEIN-JENSEN MEDIU: FUNDAȚIE, PREGĂTIRE ȘI UTILIZARE - BIOLOGIE - 2025

Mediul Löwenstein-Jensen este un mediu solid selectiv pentru izolarea și dezvoltarea bacteriilor din genul Mycobacterium, cum ar fi Mycobacterium tuberculosis, M. avium, printre altele, cu excepția speciilor de leprae, care nu este culturabilă.

Bacteriile din genul Mycobacterium nu cresc în mediile de cultură convenționale, de aceea a fost necesar să se proiecteze un mediu special pentru izolarea lor. Mediul original a fost creat de Löwenstein și ulterior modificat de Jensen.

Mediul Löwenstein-Jensen cu colonii de tuberculoză Mycobacterium. Sursa: Agarwal et al / BioMed Central Ltd., prin amabilitatea Bibliotecii de Biologie

Modificarea a constat în eliminarea colorantului roșu Congo, înlocuind-o cu o concentrație mai mare de verde malacit. De asemenea, a modificat concentrațiile de citrat de magneziu și fosfat de monopotasiu.

Mediul Löwenstein-Jensen conține în prezent amidon de cartofi, asparagină, citrat de magneziu, fosfat monopotasiu, sulfat de magneziu, verde malacit, acid nalidixic, cicloheximid, lincomicină, ouă bătute, glicerină și apă.

Micobacteriile sunt, în mod normal, izolate de site-uri care nu sunt sterile, precum spută, urină, abcese, printre altele. Aceasta înseamnă că majoritatea probelor vor conține microbiota obișnuită a zonei, plus agentul patogen.

De aceea, mediul Löwenstein-Jensen conține o serie de inhibitori în compoziția sa reprezentată de verdele de malacit, antibiotice și antifungice.

În plus, eșantioanele care provin din situri care nu sunt sterile trebuie decontaminate și neutralizate înainte de a fi însămânțate în mediu Löwenstein-Jensen.

Bază

Prezența oului și a glicerinei în mediul Löwenstein-Jensen stimulează creșterea micobacteriilor, deoarece acestea furnizează acizii grași și proteinele necesare dezvoltării acestor microorganisme.

Mediul Löwenstein-Jensen conține verde malachit, care este un inhibitor al microbiotei însoțitoare. Dar conține, de asemenea, acid nalidixic (35 pg / ml), care inhibă microbiota Gram negativă, cicloheximida (400 pg / ml), care inhibă ciupercile și drojdiile saprofite și lincomicina (2 p / ml), care inhibă microbiota Gram pozitivă.

Unele case comerciale preferă să adauge următoarea combinație de antibiotice: polimixina B 200.000 unități / L, amfotericină B 10 mg / L, carbenicilină 50 mg / L și trimetoprim 10 mg / L.

Acest mediu nu conține agar, prin urmare, solidificarea mediului apare datorită coagulării albuminei prezente în ou în timpul sterilizării.

preparare

Se cântăresc 37,3 g de mediu deshidratat în 600 ml de apă distilată la care s-au adăugat anterior 12 ml de glicerol. Amestecul se încălzește, amestecând frecvent până la dizolvarea completă. Autoclavează mediul la 121 ° C timp de 15 minute.

Pe de altă parte, o suspensie omogenă de 1000 ml de ouă proaspete trebuie preparată în condiții aseptice. Adăugați suspensia de ou la 600 ml de mediu preparat la o temperatură de 50 - 60 ° C, evitând bulele de aer.

S-au adăugat și soluții antibiotice după sterilizare în autoclav.

Turnați mediul în eprubete sterile cu șuruburi. Încălziți tuburile la 85 ° C timp de 45 minute într-o poziție înclinată.

Culoarea mediului preparat este verde acvamarin și poate prezenta pete albicioase datorită prezenței lipidelor de ou.

PH-ul mediului trebuie să fie de 7,2 ± 0,2

Depozitați tuburile la frigider și protejați de lumina directă până la utilizare. Se tempera înainte de semănat.

Există o modificare a mediului denumită „Gruft modification of the Löwenstein Jensen”. Acesta conține aceiași compuși ca mediul clasic, dar se adaugă ARN-5mg / 100 ml, iar ca inhibitori conține malachit verde 0,025 g / 100 ml, penicilină 50 U / mL și acid nalidixic 35 ug / mL.

Aplicații

Mediul Löwenstein-Jensen este utilizat pentru izolarea micobacteriilor din diferite tipuri de probe. O pată de Ziehl-Neelsen este recomandată pentru orice specimen în care este suspectată prezența micobacteriilor.

Unele probe provin din situri sterile, dar altele nu. Probele care nu sunt sterile trebuie decontaminate, după caz:

Spută

Probele de spută trebuie decontaminate după cum urmează: determinați cantitatea de probă de spută în ml și adăugați aceeași cantitate de NaOH 4% în probă și incubați la 37 ° C.

Agitați amestecul frecvent în 30 de minute. Apoi centrifugați la 3000 RPM timp de 30 de minute.

Aruncați supernatantul peste o soluție dezinfectantă fenolică. Folosiți sedimentul pentru semănat, dar mai întâi trebuie neutralizat pH-ul.

Pentru a neutraliza sedimentul, se utilizează 5% H ₂ SO ₄ în prezența indicatorului roșu al fenolului până când atinge un pH neutru care provoacă o culoare de somon.

Spălare gastrică, lavaj bronșic și aspirat bronșic

În acest caz, eșantionul trebuie centrifugat la 3000 RPM timp de 30 minute. Supernatantul este aruncat și se utilizează peletul. Pentru a decontamina sedimentul, se adaugă 3 ml NaOH 4% și se agită frecvent la 37 ° C pentru o perioadă de jumătate de oră.

Centrifugați din nou, supernatantul este aruncat și se utilizează peletele. Acesta din urmă trebuie neutralizat, așa cum este explicat în proba de spută.

Urină

Lăsați eșantionul să se așeze în frigider timp de 24 de ore. Separați supernatantul. Peleta rămasă trebuie centrifugată timp de 30 minute la 3000 RMP. Aruncați din nou supernatantul și reconstituiți peletul cu 3 ml de soluție fiziologică sterilă.

Adăugați 3 ml NaOH 4% și continuați la decontaminare și neutralizare, așa cum s-a descris anterior.

Lichid de ascită, lichid pleural, lichid cefalorahidian

În acest tip de probă este centrifugat și supernatantul este aruncat. Efectuați un Gram pe sediment sau observați direct la microscop; Dacă bacteriile nu sunt observate, etapa de decontaminare nu este necesară și nici etapa de neutralizare.

În acest caz, proba poate fi însămânțată direct folosind sediment. Dacă există bacterii, procedați la decontaminarea și neutralizarea descrisă mai sus.

biopsiile

La acest tip de probă trebuie adăugate 5 ml de apă distilată la centrifugă ulterioară la 1500 RPM timp de 10 minute. Aruncați supernatantul și re-centrifugați peletul la 3500 RPM timp de 30 de minute. Folosiți sedimentul pentru a semăna mediul de cultură.

Tampon laringian

Tamponul trebuie plasat într-un tub steril care conține părți egale apă distilată și 4% NaOH. Tamponul trebuie presat pe pereții tubului, astfel încât proba să fie diluată în lichid. Centrifugați și folosiți sedimentul. Neutralizează sedimentul așa cum s-a descris deja.

însămânțat

Mediul Löwenstein-Jensen este inoculat prin adăugarea a 0,5 ml de probă pe suprafața mediului. Rotiți tubul pentru a distribui proba pe întregul mediu. Nu folosiți mâner de platină.

Un al doilea tub care conține mediu Stonebrink poate fi însămânțat pentru a izola Mycobacterium bovis și alte specii care nu cresc pe mediul Löwenstein-Jensen.

incubație

Tuburile inoculate sunt incubate aerob la 37 ° C, cu capacul ușor desfăcut și înclinat la aproximativ 5 ° și protejat de lumină. Mediul poate fi îmbogățit cu 5-10% dioxid de carbon. Verificați culturile de două ori pe săptămână până când apar colonii.

Când proba a fost absorbită, capacele sunt strânse. Timpul maxim de incubație este de 8 săptămâni, dacă după acest timp nu există creștere, acesta este raportat ca fiind negativ.

QA

Ca și control al calității pot fi utilizate următoarele tulpini:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Streptococcus pyogenes ATCC 19615

O dezvoltare excelentă este de așteptat pentru primele trei specii menționate, pentru M. fortuitum creșterea ar trebui să fie bună, în timp ce pentru M. bovis nu se așteaptă o creștere mică sau deloc. Între timp, speciile altele decât genul Mycobacterium trebuie să fie complet inhibate.

limitări

Mediul preparat trebuie să fie protejat de lumină, expunerea prelungită la lumină determină ca mediul să se transforme de la verde la albastru, în acest caz, mediul nu mai poate fi utilizat. Acest lucru se datorează faptului că verdele malachit este fotosensibil.

Mediul, deoarece conține ouă, poate fi contaminat cu ușurință dacă nu este manipulat aseptic. Poate fi dizolvat dacă este contaminat cu bacterii proteolitice.

Cultivarea și manipularea bacteriilor din genul Mycobacterium necesită personal calificat, care cunoaște măsurile de biosecuritate care trebuie respectate pentru a evita contaminarea sau contaminarea altora.

HCl nu trebuie utilizat în etapa de neutralizare datorită formării clorurii de sodiu, care poate fi toxic pentru bacilul lui Koch.

Probele trebuie păstrate la frigider și protejate de lumină, fără a fi prelucrate.

Referinţă

1. Laboratoarele Francisco Soria Melguizo. 2009. Mediu selectiv Löwenstein-Jensen. Disponibil la adresa: f-soria.es
2. Laboratoarele Britannia. 2017. Löwenstein-Jensen medium. Disponibil la: britanialab.com.
3. Laboratoare Neogen. Löwenstein-Jensen mediu. Disponibil la adresa: foodafety.neogen.com.
4. „Löwenstein-Jensen medium”. Wikipedia, enciclopedia gratuită. 20 nov 2018, ora 15:15 UTC. 24 aprilie 2019, ora 18:34. wikipedia.org
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosticul microbiologic. 5 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
6. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnostic microbiologic Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
7. Mac Faddin J. (2003). Teste biochimice pentru identificarea bacteriilor de importanță clinică. 3. ed. Editorial Panamericana. Buenos Aires. Argentina.