MĂRGEA STANDARD DE AGAR: JUSTIFICARE, PREGĂTIRE ȘI UTILIZĂRI - BIOLOGIE - 2025

Standard , agarul count este un mediu de cultură solid, neselectiv, proiectat pentru cuantificarea aerob microbiene sarcinii prezente în probele de apă potabilă, apă uzată, băuturi lactate, printre alte alimente. Acest mediu este, de asemenea, cunoscut sub numele de PCA agar, pentru acronimul său în engleză Plate Count Agar. A fost creat în 1953 de către Buchbinder, Baris și Goldstein.

Mediul de agar cu număr standard este compus din extract de drojdie, tripteină, glucoză, agar și apă distilată. Această formulare conține elemente nutritive de bază care permit dezvoltarea încărcăturii microbiene aerobe prezente, nefiind exigente.

Diluații zecimale pentru numărarea CFU în număr normal de agar. Sursa: Quentin Geissmann

Deoarece mediul nu conține inhibitori, bacteriile pot crește fără nicio restricție, ceea ce îl face ideal pentru numărarea generală a coloniilor. Cu toate acestea, tehnica de cuantificare a plăcilor nu va detecta toate bacteriile prezente, ci doar cele care sunt capabile să crească în condițiile de mediu la care este supus agarul de însămânțare standard.

În acest sens, tehnica de cuantificare a plăcilor urmărește, în general, să determine cantitatea de bacterii de tip mezobil aerob, adică cele care se dezvoltă la temperaturi cuprinse între 25 și 40 ° C, cu o temperatură optimă de creștere de 37 ° C. .

Acest grup bacterian este foarte important, deoarece majoritatea bacteriilor patogene pentru om se găsesc acolo.

Trebuie menționat că uneori poate fi interesant să cuantificăm cantitatea de bacterii psihofilice prezente în alimente. Aceste bacterii sunt cele care cresc la temperaturi scăzute (<20 ° C) și sunt responsabile pentru ca alimentele să se descompună mai repede, chiar și atunci când sunt refrigerate.

De asemenea, bacteriile termofile, care se dezvoltă într-un interval cuprins între 50 ° C și 80 ° C sau mai mult, pot fi importante în anumite tipuri de alimente, cum ar fi conservele.

Cuantificarea microbiană este exprimată în unități de formare a coloniei (CFU) pe gram sau mililitru de probă.

Bază

Mediul de numărare standard este conceput pentru a permite creșterea cu succes a bacteriilor aerobice non-fastidioase ca extract de drojdie, tripteină și glucoză furnizează nutrienții necesari pentru o bună creștere microbiană.

Pe de altă parte, mediul are o culoare deschisă și un aspect transparent, motiv pentru care este ideal pentru vizualizarea coloniilor dezvoltate prin metoda de însămânțare profundă (turnarea într-o farfurie).

Numărarea coloniilor prin metoda de însămânțare a suprafeței Drigalski este de asemenea posibilă.

Când sarcina microbiană este mare, trebuie efectuate diluții zecimale ale eșantionului de studiu pentru a putea număra CFU-urile.

Trebuie menționat că acest mediu este recomandat de Asociația Americană de Sănătate Publică (APHA) pentru numărarea mezofilelor aerobe.

preparare

Se cântărește 23,5 g de mediu deshidratat și se dizolvă într-un litru de apă distilată. Pentru a se dizolva complet, amestecul trebuie încălzit amestecând frecvent până când fierbe. Etapele subsecvente depind de tehnica de însămânțare care trebuie utilizată.

Pentru tehnica de turnare

Distribuie distribuind 12-15 ml în eprubete. Ulterior, sterilizați într-o autoclavă la 121 ° C timp de 15 minute. Se lasă să se solidifice vertical sub forma unui bloc. Păstrați la frigider până la utilizare.

Topiți mufa când o veți folosi. Odată topit, păstrați-l într-o baie de apă la 44-47 ° C, în timp ce probele sunt preparate.

Pentru semănatul de suprafață

Sterilizați mediul într-o autoclavă la 121 ° C și apoi distribuiți 20 ml în vasele Petri sterile. Lăsați solidificarea, inversarea și păstrarea în frigider până la utilizare.

Tavați plăcile înainte de utilizare. PH-ul mediului trebuie să fie de 7,0 ± 0,2.

Utilizare

Standard Agar Count este utilizat în tehnica aerobă de numărare mezofilă în timpul analizei microbiologice a apei și alimentelor. Numărul mezofilelor aerobe este necesar, deoarece determină calitatea sanitară a eșantionului studiat.

Aplicarea acestei tehnici (folosind acest mediu) permite vizualizarea macroscopică a coloniilor izolate pentru cuantificarea acestora.

Tehnica de turnare a plăcilor (însămânțare în adâncime)

-Proces

Tehnica constă în următoarele:

1) Omogenizați proba pentru a redistribui bacteriile prezente.

2) O suspensie inițială se realizează într-o sticlă sau pungă sterilă, respectând raportul de 10 gr sau 10 ml de probă la 90 ml de diluant (10 ^-1 ).

3) Din suspensia inițială, diluțiile zecimale pertinente se efectuează în funcție de tipul de probă. Ex: (10 ^-2 , 10 ^-3 , 10 ^-4 ). Diluțiile sunt făcute cu apă peptonică sau tampon fosfat.

Pentru a face acest lucru, luați 1 ml din suspensia inițială și puneți-l în 9 ml de diluant, continuați diluțiile dacă este necesar, luând acum 1 ml din diluția 10 ^-2 și așa mai departe.

4) Luați 1 ml din fiecare diluție și puneți-le în vasele Petri sterile goale.

5) Adăugați pe fiecare placă 12 până la 15 ml de agar de număr normal topit anterior și așezați la 44 - 47 ° C.

6) Rotiți ușor plăcile pentru a distribui eșantionul în lungul agarului și lăsați-l să se solidifice.

7) Invertiți plăcile și incubați la 37 ° C în aerobioză timp de 24 până la 48 de ore.

8) La sfârșitul timpului, plăcile sunt examinate și coloniile numărate în diluția care o permite. Plăcile care au între 30 și 300 CFU sunt alese pentru număr.

Numărarea se poate face manual sau puteți utiliza echipamentele de contorizare a coloniei.

Valorile permise pe ml de eșantion pot varia de la o țară la alta, în funcție de reglementările prin care acestea sunt guvernate.

-Calcularea UFC

Calculul general se face folosind următoarea formulă:

Formula pentru calculul general al cuantificării CFU-urilor. Sursa: Administrația Națională a Medicamentelor, Alimentației și Tehnologiei Medicale (ANMAT). Analiza microbiologică a alimentelor, metodologia analitică oficială, microorganisme indicatoare. 2014 Volumul 3. Disponibil la: anmat.gov.ar

Exprimați rezultatele în 1 sau 2 cifre, înmulțind cu baza 10 corespunzătoare. Exemplu: dacă rezultatul este 16.545, acesta este rotunjit pe baza celei de-a treia cifre la 17.000 și se va exprima astfel: 1.7 x 10 ⁴ . Acum, dacă rezultatul a fost 16.436, rotunjiți-l la 16.000 și exprimați 1.6 x 10 ⁴ .

Tehnica de însămânțare a suprafeței

-Proces

-Inocular cu 0,1 ml de probă directă dacă este lichid, suspensia inițială 10 ^-1 sau diluțiile consecutive 10 ^-2 , 10 ^-3 etc, în centrul unei plăci de agar cu număr standard.

-Distribuiți eșantionul uniform cu o spatulă Drigalski sau o tijă de sticlă în formă de L. Lăsați-l să se odihnească timp de 10 minute.

-Invertați plăcile și incubați aerob la 37 ° C timp de 24 până la 48 de ore.

-Pentru a număra coloniile, alegeți plăcile care sunt cuprinse între 20 - 250 CFU.

-Calcularea UFC

Pentru calcul, se aplică factorul de diluare, care este invers. Numărul este rotunjit la 2 cifre semnificative (rotunjire în conformitate cu a treia cifră) și este exprimat în puterea bazei 10. De exemplu, dacă 224 CFU sunt contorizate în eșantion fără diluție (10 ^-1 ), 22 x 10 ¹ CFU sunt raportate , dar dacă cifra a fost 225, 23 x 10 ¹ CFU este raportată.

Acum, dacă 199 CFU sunt contorizate în diluția 10 ^-3 , 20 x 10 ⁴ CFU vor fi raportate, dar dacă 153 CFU sunt contabilizate în aceeași diluție, 15 x 10 ⁴ CFU vor fi raportate.

QA

Mediul de cultură a numărului standard poate fi evaluat folosind tulpini certificate cunoscute, precum: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.

Dacă mediul de cultură se află în condiții optime, în toate cazurile este de așteptat o creștere satisfăcătoare, cu excepția L. fermentum, care poate avea un randament regulat.

Pentru a evalua sterilitatea mediului de cultură, una sau două plăci din fiecare lot preparat (fără inoculare) ar trebui să fie incubate la 37 ° C în aerobioză timp de 24 de ore. După acest timp, nu trebuie observată nicio creștere sau schimbare de culoare pe mediu.

limitări

-Nu topiți agarul de mai multe ori.

-Mediul pregătit poate dura până la 3 luni, atât timp cât este păstrat la frigider și ferit de lumină.

-Acest mediu nu este potrivit pentru microorganisme solicitante sau anaerobe.

Referințe

1. Administrația Națională a Medicamentelor, Alimentației și Tehnologiei Medicale (ANMAT). Analiza microbiologică a alimentelor, metodologia analitică oficială, microorganisme indicatoare. 2014 Volumul 3. Disponibil la: anmat.gov.ar
2. Laboratorii Difco Francisco Soria Melguizo, SA Placă Count Agar. 2009. Disponibil la: http://f-soria.es
3. Laboratoarele Conda Pronadisa. Metoda standard Agar (PCA) conform APHA și ISO 4833. Disponibil la: condalab.com
4. Laboratoarele Britannia. Numărul plăcilor de agar. 2015. Disponibil la adresa: britanialab.com
5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B și Velázquez O. 2009. Tehnici pentru analiza microbiologică a alimentelor. A 2-a ed. Facultatea de Chimie, UNAM. Mexic. Disponibil la adresa: depa.fquim.unam