CITOCHIMIE: ISTORIE, OBIECT DE STUDIU, UTILITATE ȘI TEHNICI - BIOLOGIE - 2024

Citochimie cuprinde o serie de tehnici care se bazează pe identificarea și dispunerea substanțelor specifice din interiorul celulei. Este considerată o ramură a biologiei celulare care combină morfologia celulară cu structura chimică.

Potrivit lui Bensley, fondatorul aplicației citologiei moderne, exprimă faptul că scopul citokimiei este descoperirea organizării chimice a celulelor pentru a înțelege misterele vieții. La fel ca și studierea schimbărilor dinamice care apar pe parcursul diferitelor etape funcționale.

1: boala extramamară a lui Paget. (Hematoxylin-Eosin) 2: plăci senile observate în cortexul cerebral la un pacient cu boala Alzheimer. (Impregnare cu argint) 3: limbă de iepure, fibre de colagen (albastru). Fibrele musculare (benzi mov). (Trichromul lui Masson). 4: Țesut hepatic cu degenerare grasă. (Sudan III) 5: Ficat inflamat. Necroză. (Albastru toluenic) Surse: Wikipedia. com / Utilizator: KGH / Fișiere de domeniu public / Mohit Lalwani

În acest fel, este posibil să se determine rolul metabolic jucat de aceste substanțe în interiorul celulei.

Citochimia utilizează două metode principale. Prima se bazează pe proceduri chimice și fizice. Aceste tehnici recurg la utilizarea microscopului ca instrument indispensabil pentru a vizualiza reacțiile chimice care apar pe substanțe specifice din interiorul celulei.

Exemplu: utilizarea de coloranți citocimici, cum ar fi reacția Feulgen sau reacția PAS, printre altele.

A doua metodă se bazează pe biochimie și microchimie. Cu această metodologie este posibilă determinarea cantitativă a prezenței substanțelor chimice intracelulare.

Printre substanțele care pot fi dezvăluite într-o structură de țesut sau celulă se numără următoarele: proteine, acizi nucleici, polizaharide și lipide.

Istoria citochemiei

Tehnicile chitochimice de la invenția lor au ajutat la înțelegerea compoziției celulelor și, în timp, au apărut o varietate de tehnici care folosesc diferite tipuri de coloranți cu afinități și fundamente diferite.

Ulterior, citochimia a deschis noi orizonturi cu utilizarea anumitor substraturi pentru a arăta colorimetric prezența enzimelor sau a altor molecule în interiorul celulei.

De asemenea, au apărut alte tehnici precum imunocitochimia care a fost de mare ajutor în diagnosticul multor boli. Imunocitochimia se bazează pe reacții antigen-anticorp.

Pe de altă parte, citochemia a folosit și substanțe fluorescente numite fluorocrom, care sunt markeri excelenți pentru detectarea anumitor structuri celulare. Datorită caracteristicilor fluorocromului, evidențiază structurile la care a fost atașat.

Ce studiezi?

Diferitele tehnici citochimice utilizate pe un eșantion biologic au ceva în comun: dezvăluie prezența unui tip specific de substanță și cunosc locația sa în structura biologică aflată în evaluare, fie că este vorba despre un tip de celule sau un țesut.

Aceste substanțe pot fi enzime, metale grele, lipide, glicogen și grupări chimice definite (aldehide, tirozină etc.).

Informațiile furnizate de aceste tehnici pot oferi îndrumări nu numai pentru identificarea celulelor, ci și pentru diagnosticul diferitelor patologii.

De exemplu, petele citochimice sunt foarte utile în diferențierea dintre diversele tipuri de leucemii, deoarece unele celule exprimă anumite enzime sau substanțe cheie, iar altele nu.

Pe de altă parte, trebuie menționat că pentru ca utilizarea chimiochimiei să fie posibilă, trebuie luate în considerare următoarele:

1) Substanța trebuie imobilizată în locul în care se găsește în mod natural.

2) Substanța trebuie identificată folosind substraturi care reacționează în mod specific cu ea și nu cu alți compuși.

Utilitate

Probele care pot fi studiate prin tehnici citochimice sunt:

- Sânge periferic extins.

- măduva osoasă extinsă.

- Țesături fixate pentru tehnici histochimice.

- Celule fixate prin citocentrifugare.

Tehnicile chitochimice sunt foarte susținătoare în domeniul hematologiei, deoarece sunt utilizate pe scară largă pentru a ajuta la diagnosticarea și diferențierea anumitor tipuri de leucemii.

De exemplu: reacțiile esterazei sunt utilizate pentru diferențierea leucemiei mielomonocitice de leucemia monocitară acută.

Măduva osoasă și frotiile de sânge periferic de la acești pacienți sunt similare, deoarece unele celule sunt dificil de identificat morfologic singure. Pentru aceasta se efectuează testul esterazei.

În primul, esterasele specifice sunt pozitive, în timp ce în al doilea, esterasele nespecifice sunt pozitive.

De asemenea, sunt foarte utile în histologie, deoarece, de exemplu, utilizarea tehnicii de colorare a metalelor grele (impregnare cu argint) colorează fibrele reticulare de o culoare maro intensă în țesutul miocardic.

Tehnici în chitochimie

Cele mai utilizate tehnici vor fi explicate mai jos:

- Utilizarea coloranților

Petele utilizate sunt foarte diverse în tehnicile citochete și acestea pot fi clasificate în funcție de mai multe puncte de vedere:

Conform radicalului pentru care au o afinitate

Ele sunt împărțite în: acide, bazice sau neutre. Sunt cele mai simple și cele mai utilizate de-a lungul istoriei, permițându-ne să distingem componentele bazofile de cele acidofile. Exemplu: colorare de hematoxilină-eozină.

În acest caz, nucleele celulelor se colorează albastru (iau hematoxilină, care este colorantul de bază) și citoplasmele, roșii (iau eozina, care este colorantul acid).

În funcție de culoarea pe care o oferă

Pot fi ortocromatice sau metachromatice. Ortocromaticele sunt cele care colora structurile de aceeași culoare pe care le are colorantul. De exemplu, cazul eozinei, a cărei culoare este roșu și colora roșu.

Pe de altă parte, metachromaticele păstrează o culoare diferită de a lor, cum ar fi, de exemplu, toluidina, a cărei culoare este albastră și totuși petele violete.

Coloranți vitali sau supravitali

Sunt coloranți inofensivi, adică colorează celulele și rămân în viață. Aceste pete sunt numite vitale (de exemplu, albastru trypan pentru a colora macrofage) sau supravital (de exemplu, Janus verde pentru a colora mitocondrii sau roșu neutru pentru a colora lizozomii).

- Detectarea lipidelor cu ajutorul coloranților solubili în grăsime

Tetroxid de osmiu

Petele lipide (acizi grași nesaturați) sunt negre. Această reacție poate fi observată cu microscopul ușor, dar deoarece acest colorant este de densitate ridicată, poate fi vizualizat și cu un microscop electronic.

Sudan III

Este unul dintre cele mai utilizate. Acest colorant difuzează și solubilizează în țesuturi, acumulându-se în interiorul picăturilor lipidice. Culoarea este roșu stacojiu.

Pata neagră B din Sudan

Produce un contrast mai bun decât cele anterioare, deoarece este capabil să se dizolve și în fosfolipide și colesterol. Este utilă pentru detectarea granulelor azrofile și specifice ale granulocitelor mature și ale precursorilor acestora. Prin urmare, identifică leucemii mieloide.

- Colorarea grupului de Aldehyde (colorarea periodică a acidului Schiff)

Acidul periodic Pata Schiff poate detecta trei tipuri de grupe de aldehidă. Sunt:

- aldehide libere, prezente în mod natural în țesuturi (reacție plasmatică).

- Aldehide produse prin oxidare selectivă (reacția PAS).

- Aldehide generate de hidroliza selectivă (reacția Feulgen).

Reacție PAS

Această colorare se bazează pe detectarea anumitor tipuri de carbohidrați, cum ar fi glicogenul. Acidul periodic Schiff rupe legăturile CC ale carbohidraților datorită oxidării grupelor glicolice 1-2, reușind să elibereze grupări aldehide.

Grupurile de aldehide libere reacționează cu reactivul Schiff și formează un compus roșu-purpuriu. Aspectul culorii violet-roșu arată o reacție pozitivă.

Acest test este pozitiv în celulele plantelor, detectând amidon, celuloză, hemiceluloză și peptine. În timp ce în celulele animale detectează mucine, mucoproteine, acid hialuronic și chitină.

În plus, este util în diagnosticul de leucemii limfoblastice sau eritroleucemie, printre alte patologii de tip mielodisplastic.

În cazul glucidelor acide, se poate folosi pata albastră alciană. Testul este pozitiv dacă se observă o culoare albastru deschis / turcoaz.

Reacție plasmatică

Reacția plasmatică relevă prezența anumitor aldehide alifatice cu lanț lung, cum ar fi palma și stearalul. Această tehnică se aplică pe secțiuni histologice înghețate. Este tratat direct cu reactivul lui Schiff.

Reacția Feulgen

Această tehnică detectează prezența ADN-ului. Tehnica constă în supunerea țesutului fix la o hidroliză acidă slabă pentru a face ulterior să reacționeze cu reactivul Schiff.

Hidroliza expune grupele aldehidă dezoxiriboză la legătura dezoxiriboză-purină. Reactivul lui Schiff reacționează apoi cu grupele de aldehide care au fost lăsate libere.

Această reacție este pozitivă în nuclee și negativă în citoplasmele celulelor. Pozitivitatea este evidențiată de prezența unei culori roșii.

Dacă această tehnică este combinată cu metil verde-pironină, este posibil să se detecteze simultan ADN și ARN.

- Petele citochimice pentru structurile proteice

Pentru aceasta, poate fi utilizată reacția Millon, care folosește ca reactiv nitratul de mercur. Structurile care conțin aminoacizi aromatici vor păta roșu.

- Petele citochimice care folosesc substraturi pentru a arăta prezența enzimelor

Aceste pete se bazează pe incubația probei biologice cu un anumit substrat și produsul reacției reacționează ulterior cu săruri diazoice pentru a forma un complex colorat.

esterazele

Aceste enzime sunt prezente în lizozomii unor celule sanguine și sunt capabile să hidrolizeze esterii organici care eliberează naftol. Acesta din urmă formează un colorant azoic insolubil atunci când se leagă de o sare diazoică, colorarea locului unde are loc reacția.

Există mai multe substraturi și în funcție de care este folosit, pot fi identificate estereze specifice și estereze nespecifice. Primele sunt prezente în celulele imature ale seriei mieloide, iar cele din urmă în celule de origine monocitică.

Substratul utilizat pentru determinarea esteraselor specifice este: cloroacetatul de naftol-AS-D. În timp ce pentru determinarea esteraselor nespecifice pot fi utilizate mai multe substraturi precum acetatul de naftol AS-D, acetatul de alfa naftil și alfa naftil butiratul.

În ambele cazuri, celulele vor păta roșu profund când reacția este pozitivă.

mieloperoxidaza

Această enzimă se găsește în granulele azrofile ale celulelor și monocitelor granulocitice.

Detecția sa este utilizată pentru a diferenția leucemiile de origine mieloidă de cele limfoide. Celulele care conțin mieloperoxidase se îngălbenesc.

fosfataze

Aceste enzime eliberează acizi fosforici din diferite substraturi. Ele diferă între ele în funcție de specificul substratului, de pH și de acțiunea inhibitorilor și inactivatorilor.

Printre cele mai cunoscute sunt fosfomonoesterazele care hidrolizează esterii simpli (PO). Exemplu: fosfatază alcalină și fosfatază acidă, precum și fosfatazaze care hidrolizează legăturile (PN). Acestea sunt utilizate pentru diferențierea sindroamelor limfoproliferative și pentru diagnosticarea leucemiei cu celule păroase.

- Colorații tricromice

Trichromul Mallary-Azan

Sunt utile pentru diferențierea citoplasmei celulelor de fibrele țesutului conjunctiv. Celulele colora roșu și fibre de colagen albastru.

Trichromul lui Masson

Aceasta are aceeași utilitate ca și cea anterioară, dar, în acest caz, celulele sunt roșii și fibrele de colagen verzi.

- Coloranți care colorau organele specifice

Janus Green

Pete selectiv mitocondriile.

Sărurile de argint și acidul osmic

Petele aparatului Golgi.

Toluidină albastră

Petrește trupurile lui Nissi

Săruri de argint și PAS

Petesc fibrele reticulare și lamina bazală.

Orceină și rezorcină fuchsină

Vopsesc fibrele elastice. Cu primul sunt vopsiți maro și cu al doilea albastru profund sau violet.

- Alte tehnici utilizate în chimiochimie

Utilizarea substanțelor fluorescente sau a fluorocromelor

Există tehnici care utilizează substanțe fluorescente pentru a studia locația unei structuri într-o celulă. Aceste reacții sunt vizualizate cu un microscop special numit fluorescență. Exemplu: tehnica IFI (imunofluorescență indirectă).

Detectarea componentelor celulare prin imunocitochimie

Aceste tehnici sunt foarte utile în medicină, deoarece ajută la detectarea unei anumite structuri celulare și, de asemenea, la cuantificarea acesteia. Această reacție se bazează pe o reacție antigen-anticorp. De exemplu: tehnici ELISA (Enzyme Immuno Test).

recomandări

- Este necesar să folosiți frotiuri de control pentru a evalua performanța bună a coloranților.

- Frotiile proaspete trebuie utilizate pentru a fi supuse unei colorații citochete. Dacă nu este posibil, acestea trebuie păstrate împotriva luminii și păstrate la 4 ° C.

- Trebuie avut grijă ca fixativul utilizat să nu influențeze negativ substanța care trebuie investigată. Cu alte cuvinte, trebuie împiedicat să o poată extrage sau inhiba.

- Timpul de utilizare a fixativilor trebuie respectat, deoarece, în general, ar trebui să dureze doar câteva secunde, deoarece expunerea frotiei mai mult timp la fixativ poate deteriora unele enzime.

Referințe

1. „Citochimie.“ Wikipedia, enciclopedia gratuită. 30 iunie 2018, ora 17:34 UTC. 9 iulie 2019, 02:53 Disponibil în: wikipedia.org
2. Villarroel P, de Suárez C. Metode de impregnare metalică pentru studiul fibrelor reticulare miocardice: studiu comparativ. RFM 2002; 25 (2): 224-230. Disponibil pe: scielo.org
3. Santana A, Lemes A, Bolaños B, Parra A, Martín M, Molero T. Citochimia fosfatazei acide: considerente metodologice. Rev Diagn Biol. 200; 50 (2): 89-92. Disponibil pe: scielo.org
4. De Robertis E, De Robertis M. (1986). Biologie celulară și moleculară. Ediția a 11-a. Editorial Ateneo. Buenos Aires, Argentina.
5. Instrumente clasice pentru studierea biologiei celulare. TP 1 (material suplimentar) - Biologie celulară. Disponibil la adresa: dbbe.fcen.uba.ar