TAMPON FOSFAT (PBS): RAȚIUNI, PREPARARE ȘI UTILIZĂRI - BIOLOGIE - 2025

Fosfat tampon, soluție salină tamponată cu fosfat sau BPS este un tampon izotonic, a cărei funcție este de a menține pH - ul și presiunea osmotică cât mai aproape de mediul natural biologic (fiziologic). Acronimul PBS înseamnă soluție salină tamponată cu fosfat.

PH-ul și osmolaritatea sunt două aspecte foarte importante care trebuie controlate în anumite protocoale de laborator. În cazul pH-ului, este esențial ca acesta să fie controlat, în special în reacțiile biochimice, deoarece acestea pot varia sau nu sunt efectuate dacă reactanții sunt la un pH necorespunzător.

PBS fosfat soluție salină tamponată la două pH-uri diferite. Sursa: Pixinio.com

Între timp, controlul osmolarității este esențial mai ales atunci când se lucrează cu celule vii, deoarece membranele plasmatice ale celulelor reacționează în funcție de concentrația de solute în care se găsesc.

Dacă celulele sunt transferate într-un mediu hipertonic, ele vor fi deshidratate, deoarece gradientul de apă va fi transportat în partea în care există o concentrație mai mare de soluții. Dacă, pe de altă parte, celulele sunt plasate într-un mediu hipoton, celulele vor absorbi lichidul până când sunt lizate.

De aceea, tamponul PBS este utilizat pentru protocoalele de laborator care necesită menținerea celulelor in vitro, în acest fel celulele nu vor fi deteriorate.

PBS este format dintr-o combinație de săruri, cum ar fi clorură de sodiu, fosfat de sodiu, clorură de potasiu și fosfat de potasiu. Compoziția PBS poate varia în funcție de protocol.

Bază

Practic, funcția tamponului de fosfați este de a menține un pH fiziologic constant împreună cu o concentrație de electroliți similară cu cea găsită în interiorul corpului.

În acest mediu, celulele sunt capabile să rămână stabile, deoarece condițiile fiziologice sunt simulate pe cât posibil.

Dacă este necesar, alți compuși pot fi adăugați la formularea PBS inițială, de exemplu, adăugarea EDTA la tampon este utilă pentru spălarea globulelor roșii din testul de incompatibilitate încrucișată.

EDTA împiedică fracțiunea de complement C1 prezentă în ser să fie clivată și lizată de globulele roșii, adică evită rezultate false de incompatibilitate. În plus, EDTA ajută la disocierea celulelor.

preparare

Cantitatea de săruri care trebuie cântărită pentru prepararea soluției saline tamponate cu fosfat PBS va depinde de cantitatea care trebuie preparată:

-Soluție salină tamponată cu fosfat (10X PBS)

Pentru un litru de soluție:

A cantari:

80,6 g de NaCl,

2,2 g KCl,

11,5 g de Na ₂ HPO ₄ ,

2,0 g KH ₂ HPO ₄

Tehnica de pregătire

Puneți sărurile grele într-un pahar, adăugați suficientă apă (80%) și amestecați pe placa de agitare cu o bară magnetică până la dizolvarea sărurilor.

Prepararea PBS folosind o placă de agitare cu o bară magnetică. Sursa: Utilizator: Ruhrfisch, Wikipedia. com

Se filtrează pentru a elimina particulele nedizolvate. Folosiți filtre cu pori de 0,45 µm. Autoclavează și distribuie aseptic într-o capotă cu flux laminar în borcane de sticlă cu capace.

Soluția 10X (concentrată) nu ajustează pH-ul. Reglarea se face o dată diluată până la concentrația de tampon PBS 1X (diluție 1:10).

-Buter salina fosfat (1X PBS)

1X PBS poate fi preparat direct cântărind cantitățile corespunzătoare din fiecare sare sau poate fi preparat prin diluarea soluției stoc (1:10) cu apă distilată sterilă.

-Pentru a prepara direct un litru de 1X PBS soluție salină tamponată cu fosfat, cântărește:

8,06 g de NaCl,

0,22 g KCl,

1,15 g de Na ₂ HPO ₄ ,

0,20 g de KH ₂ HPO ₄

Tehnica de pregătire

Procedați după cum se explică în soluția concentrată. Ulterior, trebuie ajustat pH-ul. Pentru a face acest lucru, măsurați pH-ul și în funcție de rezultat, folosiți acidul (HCl) sau baza (NaOH) pentru a scădea sau a ridica pH-ul respectiv, după caz, până la 7.4.

Acidul sau baza se adaugă picătură la picătură în timp ce se monitorizează valoarea pH-ului soluției folosind un pHmetru. Filtrează, autoclavează și distribuie în mod aseptic în tuburi sau borcane conice, după cum este necesar.

-Pentru a pregăti 1X PBS din soluția de stoc 10X:

Faceți o diluție de 1:10. De exemplu, pentru a prepara 1 litru de 1X PBS, măsurați 100 ml soluție stoc și adăugați 700 ml de apă distilată sterilă. Reglați pH-ul și completați cantitatea de apă până la 1000 ml.

Tamponul preparat PBS este incolor și clar.

PBS zilnic poate fi păstrat la temperatura camerei, iar restul în frigider.

Soluții pentru ajustarea pH-ului

acid clorhidric

Pentru 100 ml 1 HCL molar (acid clorhidric).

Măsurați 91 ml de apă distilată și puneți-l într-un pahar de 250 ml.

Măsurați 8,62 ml HCl concentrat și adăugați-l încet în paharul care conține apa (nu faceți niciodată invers). În cazul manipulării acizilor tari (substanțe puternic corozive), luați măsurile de biosecuritate relevante.

Amestecă timp de 5 minute, de preferință, folosind o placă de agitare cu o bară magnetică în interiorul paharului. Se transferă într - un balon de 100 ml și se completează până la 100 ml cu distilat H ₂ O.

NaOH

Pentru 100 ml NaOH (hidroxid de sodiu) 10 molar.

Măsurați 40 ml de apă distilată și puneți-l într-un pahar de 250 ml. Măsurați 40 g de NaOH și adăugați în apă. Se amestecă folosind o placă de agitare cu o bară magnetică în interiorul paharului.

Transferați într-un balon volumetric de 100 ml și completați marcajul cu apă distilată. Respectă reglementările biosecurității, deoarece această reacție este exotermică (eliberează energie sub formă de căldură).

Dacă doriți să pregătiți alte cantități de soluție salină fosfat, puteți consulta următorul tabel:

Sursa: «Laboratorul de Genomică Virală și Umană, Școala de Medicină UASLP»

Aplicații

Este utilizat în principal în biologie celulară, imunologie, imunohistochimie, bacteriologie, virologie și laboratoare de cercetare.

Este ideal pentru spălarea celulelor prin centrifugare (globule roșii), spălarea monostratului celular, în tehnici de elipsometrie spectroscopică, în cuantificarea biofilmelor bacteriene, în menținerea culturilor celulare pentru viruși, ca soluție de spălare în tehnica imunofluorescenței indirecte și în tehnici pentru caracterizarea anticorpilor monoclonali.

De asemenea, este utilizat pentru transportul celulelor sau țesuturilor, ca diluant pentru numărarea celulelor, pentru prepararea enzimelor celulare (trypsină), ca diluant pentru metoda de desecare a biomoleculelor și pentru prepararea altor reactivi.

Pe de altă parte, Martin și colab., În 2006, au demonstrat că PBS este util în laboratoarele de științe medico-legale, în special în recuperarea spermatozoizilor din frotii vaginale sau în recuperarea celulelor vaginale din frotiuri. În acest fel poate fi stabilit dacă a existat o relație sexuală.

limitări

-Unele substanțe tampon PBS conțin o substanță numită azid de sodiu ca conservant. Acest compus poate genera substanțe explozive dacă vine în contact cu plumbul sau cuprul. Din acest motiv, trebuie să aveți grijă specială atunci când aruncați acest reactiv în scurgere. Dacă este aruncat în acest fel, trebuie adăugată apă abundentă pentru a o dilua la maximum.

-Zincul nu trebuie adăugat în tamponul de fosfați, deoarece determină precipitarea unor săruri.

-Wangen și colaboratorii din 2018 au stabilit că utilizarea PBS nu a fost potrivită pentru spălarea celulelor primare de leucemie mieloidă acută (AML) extrasă din sângele periferic, din cauza faptului că multe celule se pierd prin liză, cu o scădere mare a materialului. proteină.

Prin urmare, ei au stabilit că celulele AML primare nu trebuie spălate cu PBS după depozitarea în azot lichid.

Referințe

1. Coll J. (1993). Tehnici de diagnostic în virologie. Ed. Díaz de Santos. 360 pg
2. Rodríguez M, Ortiz T. Cultura celulară. Schimbare de mediu. Departamentul de citologie normală și patologică și histologie Universitatea din Sevilla. Disponibil la adresa personal.us.es
3. Prepararea soluției saline tamponate cu fosfat (PBS). (2008). Proceduri de operare standard (POS) Laboratorul de Genomică Umană și Virală UASLP Școala de Medicină. Disponibil la adresa: genomica.uaslp.mx
4. "Salină tampon fosfat". Wikipedia, enciclopedia gratuită. 3 Apr 2019, ora 19:36 UTC. 13 Apr 2019, 02:57 ro.wikipedia.org.
5. Pietrasanta L, Von-Bilderling C. Subiecte în biofizica moleculară. Disponibil la adresa: users.df.uba.ar
6. Rediar. Manual. PBS + EDTA. Disponibil la adresa: felsan.com.ar
7. Martin NC, Pirie AA, Ford LV, Callaghan CL, McTurk K, Lucy D, Scrimger DG. Utilizarea de soluție salină tamponată cu fosfat pentru recuperarea celulelor și a spermatozoizilor din tampoane. Sci Justiție. 2006; 46 (3): 179-84. Disponibil în: ncbi.nlm.nih.gov
8. Wangen R, Aasebø E, Trentani A, și colab. Metoda de conservare și spălarea salină tamponată cu fosfat afectează proteomul leucemiei mieloide acute. Int J Mol Sci. 2018; 19 (1): 296. Disponibil în: ncbi.nlm.nih.gov
9. Martínez R, Gragera R. (2008). Bazele teoretice și practice ale istochimiei. Consiliul Superior al Investigațiilor Științifice. Madrid. Disponibil la adresa: books.google.co.ve