PETĂ DE ZIEHL-NEELSEN: RAȚIUNE, REACTIVI ȘI TEHNICĂ - BIOLOGIE - 2025

Ziehl-Neelsen o tehnica de colorare pentru a identifica microorganismele de acid rezistentă la alcool (ARA). Denumirea acestei proceduri de microbiologie se referă la autorii săi: bacteriologul Franz Ziehl și patologul Friedrich Neelsen.

Această tehnică este un tip de colorare diferențială, care presupune utilizarea diferiților coloranți pentru a crea contrast între structurile pe care doriți să le observați, să le diferențiați și să le identificați ulterior. Pata Ziehl-Neelsen este utilizată pentru a identifica anumite tipuri de microorganisme.

Pata Ziehl-Neelsen

Unele dintre aceste organisme sunt micobacterii (de exemplu, Mycobacterium tuberculosis), nocardie (de exemplu, Nocardia sp.) Și unii paraziți unicelulari (de exemplu, Cryptosporidium parvum). Multe dintre bacterii pot fi clasificate printr-o tehnică comună numită colorație Gram.

Cu toate acestea, unele grupuri bacteriene necesită alte metode pentru a le putea identifica. Tehnici precum pata Ziehl-Neelsen necesită combinații de coloranți cu căldură pentru fixarea primului de peretele celular.

Urmează apoi un proces de albire care permite două rezultate: rezistența sau sensibilitatea la decolorare de acizi și alcooli.

Bază

Motivul acestei tehnici de colorare se bazează pe proprietățile peretelui celular al acestor microorganisme. Peretele este format dintr-un tip de acizi grași numiți acizi micolici; Acestea se caracterizează prin faptul că au lanțuri foarte lungi.

Când acizii grași au structuri foarte lungi, aceștia pot reține coloranții mai ușor. Unele genuri bacteriene sunt foarte greu de colorat prin colorația Gram, din cauza conținutului ridicat de acizi micolici din peretele celular.

Pata Ziehl-Neelsen folosește compusul fenolic carbol fuchsin, o pată de bază. Aceasta are capacitatea de a interacționa cu acizii grași ai peretelui celular, care are textura ceroasă la temperatura camerei.

Colorarea de carbol fuchsin este îmbunătățită în prezența căldurii, pe măsură ce ceara se topește și moleculele de colorant se deplasează mai rapid în peretele celular.

Acidul care este folosit mai târziu servește la decolorarea celulelor care nu au fost pătate, deoarece peretele lor nu a fost suficient de legat de colorant; prin urmare, rezistența înălbitorului acid este capabilă să elimine colorantul acid. Celulele care rezistă la această decolorare se numesc acid-rapid.

Colorant secundar

După decolorarea eșantionului, acesta este contrastat cu un alt colorant numit colorant secundar. În general, se folosește albastru de metilen sau verde malacit.

Colorantul secundar pătează materialul de fundal și, prin urmare, creează un contrast cu structurile care au fost colorate în prima etapă. Doar celulele decolorate absorb al doilea colorant (se rețin) și își iau culoarea, în timp ce celulele cu aciditate își păstrează culoarea roșie.

Această procedură este frecvent utilizată pentru identificarea Mycobacterium tuberculosis și Mycobacterium leprae, care sunt numite bacili cu acid rapid.

Reactivi

Colorant primar

Se folosește 0,3% carbol fuchsin (filtrat). Acest colorant este preparat dintr-un amestec de alcooli: fenol în etanol (90%) sau metanol (95%), iar în acest amestec sunt dizolvate 3 grame de fucsină de bază.

Soluție de albire

În această etapă, se pot utiliza soluții de 3% acid alcoolic sau 25% acid sulfuric.

Vopsea secundară (contra-vopsitorie)

Colorantul cel mai folosit pentru contrastul probelor este de obicei 0,3% albastru de metilen. Cu toate acestea, pot fi utilizate și altele, cum ar fi 0,5% verde malacit.

Tehnică

Procedura de colorare rapidă a acidului

Pregătiți un frotiu bacterian

Acest preparat se face pe o lamelă curată și uscată, respectând măsurile de sterilitate.

Uscare cu frotiu

Lăsați frotiul să se usuce la temperatura camerei.

Se încălzește proba

Proba trebuie încălzită aplicând foc pe diapozitivul de mai jos. O fixare a alcoolului se poate face atunci când frotiul nu a fost preparat cu spută (tratat cu hipoclorit de sodiu pentru albitul acestuia) și dacă nu va colora imediat.

M. tuberculoza este îndepărtată cu înălțător și în timpul procesului de colorare. Fixarea la căldură a sputei netratate nu va ucide M. tuberculosis, în timp ce fixarea alcoolului este bactericidă.

Acoperiți pata

Pata este acoperită cu soluția de carbol fuchsin (pata de bază primară).

Încălziți pata

Aceasta se face timp de 5 minute. Ar trebui să observați o evoluție a aburului (aproximativ 60 ° C). Este important să nu supraîncălziți și să evitați arderea probei.

În ceea ce privește încălzirea petei, trebuie să aveți mare grijă la încălzirea carbol fuchsin, mai ales dacă colorarea se efectuează pe o tavă sau alt recipient în care au fost colectate substanțe chimice extrem de inflamabile de la colorarea anterioară.

Doar o flacără mică trebuie aplicată sub lamele folosind un tampon luminat anterior umezit cu câteva picături de alcool acid, metanol sau 70% etanol. Evitați utilizarea unui tampon mare îmbibat cu etanol, deoarece acesta este un pericol de incendiu.

Spălați pata

Această spălare trebuie făcută cu apă curată. Dacă apa de la robinet nu este curată, spălați frotiul cu apă filtrată sau distilată, de preferință.

Acoperiți frotiul cu alcool acid

Acest alcool acid trebuie să fie la 3%. Acoperirea se efectuează timp de 5 minute sau până când frotiul este suficient decolorat, adică de culoare roz pal.

Trebuie avut în vedere faptul că alcoolul acid este inflamabil; prin urmare, trebuie folosit cu mare grijă. Evitați să fiți aproape de surse de aprindere.

Spălați pata

Spălarea trebuie să fie cu apă curată și distilată.

Acoperiți frotiul cu pata

Poate fi o pată de malachit verde (0,5%) sau albastru de metilen (0,3%) timp de 1 până la 2 minute, folosind mai mult timp dacă frotiul este subțire.

Spălați pata

Din nou trebuie folosită apă curată (distilată).

A se scurge

Partea din spate a lamelelor trebuie curățată și pata trebuie plasată pe un suport de scurgere pentru a se usca la aer (nu folosiți hârtie absorbantă pentru uscare).

Examinați frotiul sub microscop

Trebuie să se folosească uleiul de obiectiv și de imersiune 100X. Scanați frotiul în mod sistematic și înregistrați observațiile pertinente.

Interpretați rezultatele

Teoretic, microorganismele care păstrează o culoare roșiatică sunt considerate pozitive rapid-acid (AAR +).

Dimpotrivă, dacă microorganismele pătează albastru sau verde, în funcție de colorantul folosit ca contra-colorant, ele sunt considerate negativ-acid-rapid (AAR-).

Referințe

1. Apurba, S. și Sandhya, B. (2016). Elementele esențiale ale microbiologiei practice (ediția I). Edituri Jaypee Brothers Medical.
2. Bauman, R. (2014). Microbiologie cu boli prin sistemul corpului (ediția a 4-a). Pearson Education, Inc.
3. Heritage, J., Evans, E. și Killington, A. (1996). Microbiologie introductivă (ediția I). Presa universitară din Cambridge.
4. Morello, J., Granato, P. Wilson, M. & Morton, V. (2006). Manual de laborator și carte de lucru în microbiologie: aplicații pentru îngrijirea pacienților (ediția a 11-a). McGraw-Hill Education.
5. Vasanthakumari, R. (2007). Cartea de microbiologie (ediția I). Publicatii BI PVT.