COLORAREA KINYOUN: RAȚIUNI ȘI TEHNICI - BIOLOGIE - 2025

Colorația Kinyoun este o tehnica de colorare utilizată pentru bacterii petelor și paraziți alcool rezistent la acizi. S-a născut din modificarea colorației Ziehl-Neelsen; Ambele tehnici sunt interpretate în același mod, dar diferă în două elemente: în prepararea reactivului principal și prin aceea că tehnica Kinyoun nu utilizează căldură.

Din acest motiv este cunoscută și sub denumirea de pata rece Ziehl-Neelsen sau Kinyoun modificată la rece. Este indicat pentru colorarea Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, micobacterii atipice, Nocardias sp, Cryptosporidium parvum, Cryptosporidium meleagridis, Cryptosporidium felis, Cryptosporidium muris și Cyclosporas cayetanensis.

Cryptosporidium parvum colorat cu pata Kinyoun. Punlop Anusonpornperm, de la Wikimedia Commons

Este demn de remarcat faptul că Nocardia se pătează slab cu această tehnică, deoarece sunt parțial rezistente la alcool, astfel încât pentru acest gen există o modificare a metodologiei.

La rândul său, tehnica Kinyoun rece a fost combinată cu tehnica tricrom modificată de Didier pentru detectarea coccidiei (Cryptosporidium parvum și Isospora belli) și a sporilor microsporidiei (Enterocytozoon bieneusi și Encephalitozoon intestinalis).

Bază

Principalul reactiv de colorare este carbolfuchsin sau carbol fuchsin, care are proprietatea de a se lega de acizii carbolici existenți în peretele celulelor ceroase bogate în lipide (acizi micolici) a micobacteriilor și a anumitor paraziți.

Această legătură nu este contracarată de înălbitorul acid; prin urmare, microorganismele sunt definite ca acid-rapid.

Spre deosebire de tehnica Ziehl-Neelsen - care fixează vopseaua prin căldură -, în tehnica Kinyoun această etapă nu este necesară, deoarece soluția carbolică de fuchsin preparată pentru această tehnică conține o concentrație mare de fenol.

Fenolul dizolvă materialul lipidic din peretele celular, permițând intrarea colorantului carbolfuchsin. După ce colorantul pătrunde, rămâne fixat în ciuda spălării cu alcool acid.

În acest fel, microorganismele cu aciditate rapidă capătă culoarea roșie caracteristică, în timp ce tot ceea ce nu este acid-rapid devine decolorat și pătează albastru.

Tehnică

materiale

- modificat carbol fuchsin.

- Alcool -acid.

- Albastru de metil.

Prepararea Kinyoun carbol fuchsin

- Fuchsin de bază: 4 gr.

- Fenol: 8 ml.

- alcool (95%): 20 ml.

- Apă distilată: 100 ml.

Fucsina de bază trebuie dizolvată lent în alcool, amestecând constant. Fenolul cristalizat este apoi topit într-o baie de apă la 56 ° C. Odată dizolvată, la soluția de fuchsină preparată mai sus se adaugă 8 ml.

Prepararea alcoolului acid

- Acid clorhidric concentrat: 3 ml.

- Etanol (95%): 97 ml.

Trebuie măsurat, îmbinat și amestecat.

Prepararea colorantului de contrast albastru de metilen

- Albastru de metilen: 0,3 g.

- Apă distilată: 100 ml.

Se cântărește și se dizolvă.

Tehnica de colorare Kinyoun

1- Pregătiți un frotiu direct din probă, care poate fi spută, lichid pulmonar, sediment de urină, lichid cefalorahidian sau fecale, printre altele; sau dintr-o suspensie de microorganisme obținute din colonii pure dezvoltate în mediile de cultură primară.

2- Fixați frotiul cu căldură.

3- Așezați frotiul pe podul de colorare și acoperiți cu reactivul pregătit Kinyoun carbol fuchsin. Lasa-l sa se odihneasca 3 - 5 minute.

4- Se spală cu apă distilată.

5- Înălbitori cu alcool acid timp de 3 minute și spălați din nou cu apă distilată.

6- Înălbitori din nou cu alcool acid timp de 1 sau 2 minute, până când nu se mai colorează.

7- Spălați-vă cu apă distilată și lăsați să se scurgă, așezând lamela într-o poziție verticală.

8- Acoperiți preparatul cu albastru de metilen și lăsați să acționeze 4 minute.

9- Se spală cu apă distilată și se lasă să se usuce.

10- Examinați la 40X și apoi la 100X.

Pentru a îmbunătăți și a accelera colorarea microorganismelor cu aciditate rapidă, adăugați 1 picătură de agent de umectare (cum ar fi Tergitol nr. 7) la 30 sau 40 ml de Kinyoun Carbol Fuchsin.

Unele laboratoare schimbă colorantul de contrast albastru de metilen în verde luminos sau acid picric; primul dă o culoare verde fundalului, iar al doilea generează o culoare galbenă.

Tehnica specială Kinyoun pentru Nocardii

Pentru a îmbunătăți colorarea bacteriilor din genul Nocardia se utilizează o modificare a petei Kinyoun. Tehnica este următoarea:

1- Acoperiți frotiul cu Kinyoun carbol fuchsin timp de 3 minute.

2- Spălați cu apă distilată.

3- Se decolorează scurt cu alcool acid preparat la 3% până când nu se mai colorează.

4- Spălați din nou cu apă distilată.

5- Acoperiți preparatul cu albastru de metilen și lăsați-l să acționeze 30 de secunde.

6- Se spală cu apă distilată și se lasă să se usuce.

Tehnica combinată carbol fuchsin și tricrom modificată de Didier

Această tehnică este recomandată pentru analiza probelor de scaun pentru sporii de coccidia și spor Microsporidium în același timp. Procedura de urmat este următoarea:

1- Acoperiți frotiul cu Kinyoun carbol fuchsin timp de 10 minute.

2- Scoateți colorantul și spălați-l cu apă distilată.

3- Înălbitor timp de 30 de secunde cu alcool acid clorhidric.

4- Spălați din nou cu apă distilată.

5- Acoperiți frotiul cu soluție tricromă timp de 30 de minute la 37 ° C.

6- Se spală cu apă distilată.

7- Înălbitor timp de 10 secunde cu alcool acid acetic.

8- Spălați frotiul timp de 30 de secunde folosind etanol 95%.

QA

Ca un control pozitiv, frotiile cu tulpini de tuberculoză Mycobacterium sunt preparate și colorate cu reactivi pregătiți pentru a verifica dacă bacteriile iau culoarea corespunzătoare (roșu-fuchsia).

Controalele negative pot fi, de asemenea, utilizate prin prepararea frotiurilor cu orice tulpină în afară de alcoolul acid rapid, verificând astfel că întreaga probă ia culoarea contrastantă.

Tehnica Kinyoun în comparație cu tehnica Ziehl-Neelsen

Tehnica Kinyoun este mai simplă, deoarece elimină etapa de încălzire, dar principalul său avantaj este că evită emisiile de vapori, foarte toxici și care provoacă cancer pe termen lung. Prin urmare, pata Kinyoun este mai sigură pentru colorarea personalului.

Este important să se țină seama de faptul că reactivii nu intră în contact direct cu pielea, deoarece sunt corozivi și înălbitorul este inflamabil.

În ceea ce privește dezavantajele, un frotiu negativ nu indică neapărat că organismul nu este prezent. Mai mult, prezența resturilor celulare poate duce la falsuri pozitive, ceea ce duce la confuzie în diagnostic.

Referinţă

1. Chimie clinică aplicată. (2016). Kit BK Kinyoun.Disponibil la: cromakit.es
2. Orozco-Rico Miguel. Pata de Kinyoun și două Coccidia la HIV. Jurnalul medical MD. 2011; 3 (2): 137
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Diagnostic microbiologic Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana SA
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosticul microbiologic. (Ediția a 5-a). Argentina, Editorial Panamericana SA
5. Colaboratorii Wikipedia. „Pata de Kinyoun”. Wikipedia, enciclopedia gratuită. Wikipedia, Enciclopedia gratuită, 8 februarie 2018. Web. 5 ianuarie 2019.
6. Combol A, Fernández N, Figueredo E, Acuña A, Zanetta E. Implementarea unei tehnici de colorare pentru diagnosticul simultan al Coccidia și Microsporidia. Institutul de Igienă al Universității din Republica. Montevideo. Uruguay. Disponibil la adresa: higiene.edu.uy