COLORAREA SPORILOR: RAȚIUNI, TEHNICI ȘI UTILIZĂRI - BIOLOGIE - 2025

Colorării de spori este metodologia utilizată pentru a colora structurile de rezistență care formează unele genuri bacteriene , atunci când , în condiții nefavorabile; Aceste structuri corespund unei forme de supraviețuire.

Există multe genuri care formează spori; cu toate acestea, principalele sunt Bacillus și Clostridium. Aceste genuri sunt considerate mai relevante, deoarece au specii patogene pentru om.

Colorarea sporilor prin metoda Shaeffer - Fulton sau Wirtz-Conklin. Și tambe (încărcător original), de la Wikimedia Commons

Fiecare bacil poate da naștere unei spore. În momentul colorarii preparatului, sporul poate fi găsit în interiorul bacilului (endospor) sau în afara acestuia (exosporul). Cu tehnici convenționale de colorare pentru bacterii - cum ar fi pata Gram - sporii rămân incolori.

În prezent, există mai multe metodologii de colorare care sunt capabile să pătrundă în structura groasă a sporei pentru a o vopsi. Aceste metodologii sunt foarte variate; Acestea includ tehnica Dorner, pata Möeller și metodologia Shaeffer - Fulton, cunoscută și sub denumirea de Wirtz-Conklin.

Dintre toate tehnicile menționate, metodologia Shaeffer-Fulton este cea mai utilizată în laboratoarele de rutină. Este numit după doi microbiologi care au creat colorația în 1930: Alicia Shaeffer și MacDonald Fulton. Cu toate acestea, tehnica este numită uneori Wirtz-Conklin după doi bacteriologi din anii 1900.

Bază

Sporii nu se pătează cu pete convenționale, deoarece au un perete foarte gros. Compoziția complexă a sporilor împiedică intrarea majorității coloranților.

Dacă sporul este studiat din exterior în interior, se observă următoarele straturi: în primul rând, există exosporiul, care este cel mai subțire și exterior strat format din glicoproteine.

Urmează cuticula, care oferă rezistență la temperaturi ridicate, urmată de cortexul compus din peptidoglican. Mai târziu este peretele bazei care protejează protoplastul.

Sporul este o structură deshidratată care conține 15% calciu și acid dipicolinic. Prin urmare, majoritatea tehnicilor de colorare a sporilor se bazează pe aplicarea căldurii, astfel încât colorantul să poată pătrunde în structura groasă.

După ce sporul este colorat, nu poate elimina colorantul. În tehnica Shaeffer - Fulton, verdele de malachit intră în celulele vegetative și, atunci când se aplică căldură, pătrunde în endospor, precum și în expoziții.

Prin spălarea cu apă, colorantul este îndepărtat din celula vegetativă. Acest lucru se întâmplă deoarece colorantul verde malachit este ușor de bază, deci se leagă slab de celula vegetativă.

În schimb, nu poate ieși din spor și, în cele din urmă, bacilul este contracarat cu safranină. Această bază este valabilă pentru restul tehnicilor, în care se întâmplă ceva similar.

Tehnici de colorare a sporilor

Pentru a realiza colorarea sporilor, trebuie obținută o cultură pură a tulpinii suspecte de studiat.

Cultura este supusă la temperaturi extreme timp de 24 de ore pentru a stimula microorganismul spre sporulare. Pentru aceasta, cultura poate fi introdusă într-un cuptor la 44 ° C sau într-un frigider (8 ° C) timp de 24 sau 48 de ore.

Dacă este lăsat prea mult la temperaturile menționate, se vor observa doar expoziții, deoarece toate endosporesele vor fi ieșit deja din bacil.

La sfârșitul timpului, trebuie să se pună câteva picături de soluție fiziologică sterilă pe o lamelă curată. Apoi se ia o mică parte din cultură și se face o răspândire fină.

După aceea, este lăsat să se usuce, fixat la căldură și vopsit cu una dintre tehnicile explicate mai jos:

Tehnica Dorner

1- Pregătiți într-o eprubetă o suspensie concentrată a microorganismului sporulat în apă distilată și adăugați un volum egal de Kinyoun carbol fuchsin filtrat.

2- Puneți tubul într-o baie cu apă clocotită, între 5 și 10 minute.

3- Pe o lamelă curată, amestecați o picătură din suspensia anterioară cu o picătură de soluție apoasă de nigrosină 10%, fiartă și filtrată.

4- Răspândiți și uscați repede la foc blând.

5- Examinați cu un obiectiv 100X (imersiune).

Sporii sunt roșii și celulele bacteriene apar aproape incolore pe un fundal gri închis.

Tehnică modificată Dorner

1- O suspensie a microorganismului sporulat este întinsă pe o lamelă și fixată la căldură.

2- Eșantionul este acoperit cu o bandă de hârtie de filtru la care se adaugă carbol fuchsin. Colorantul este încălzit timp de 5 până la 7 minute cu flacăra arzătorului Bunsen până la generarea evoluției vaporilor. Apoi, hârtia este îndepărtată.

3- Preparatul este spălat cu apă și apoi uscat cu hârtie absorbantă.

4- Acoperiți frotiul cu o peliculă subțire de 10% nigrosină, folosind un al doilea diapozitiv pentru a răspândi nigrosina sau un ac.

Colorația luată de spori și bacterii este aceeași cu cea descrisă în stadiul tehnicii.

Shaeffer - tehnica Fulton sau Wirtz-Conklin

1- Faceți un frotiu fin cu o suspensie a microorganismului sporulat pe o lamelă și fixați-l la căldură.

2- Acoperiți lamela cu 5% soluție apoasă de malacit verde (puteți așeza o hârtie de filtru pe lamelă).

3- Încălziți flacăra arzătorului Bunsen pentru a produce eliberarea de vapori și a elimina flacăra. Repetați operația timp de 6 până la 10 minute. Dacă soluția verde de malacit se evaporă prea mult în timpul procedurii, se pot adăuga mai multe.

4- Scoateți hârtia de filtrare (dacă este instalată) și spălați-o cu apă.

5- Acoperiți lamela cu 0,5% safranină apoasă timp de 30 de secunde (unele variante ale tehnicii folosesc o safranină apoasă 0,1% și lăsați-o timp de 3 minute).

Cu această tehnică, sporii apar verzi și bacilii roșii.

Are dezavantajul că endosporalele culturilor tinere nu se pătează bine, deoarece apar extrem de limpezi sau incolore. Pentru a evita acest lucru, se recomandă utilizarea culturilor de 48 de ore de incubare.

Tehnica Möeller

1- Acoperiți frotiul cu cloroform timp de 2 minute.

2- Aruncați cloroformul.

3- Acoperiti cu 5% acid cromic timp de 5 minute.

4- Se spală cu apă distilată

5- Foaia este acoperită cu carbol fuchsin-fenicada și este expusă la flacăra arzătorului Bunsen până la emiterea de vapori; apoi se scoate din flacără pentru câteva clipe. Operația se repetă până la finalizarea a 10 minute.

6- Se spală cu apă.

7- Folosiți etanol acidulat (alcool clorhidric) pentru a decolora. Se lasă timp de 20 sau 30 de secunde.

8- Se spală cu apă distilată.

9- Se contrastează acoperind foaia cu albastru de metilen timp de 5 minute.

10- Se spală cu apă distilată.

11- Se lasă să se usuce și proba este dusă la microscop.

Sporii apar roșii și bacilii albastru. Este important să nu inspirați în vapori, deoarece sunt toxici și pe termen lung pot fi cancerigeni.

Tehnică modificată Möeller fără căldură

În 2007 Hayama și colaboratorii săi au creat o modificare a tehnicii Möeller. Ei au eliminat etapa de încălzire a colorantului și l-au înlocuit adăugând 2 picături de agent tensioactiv Tergitol 7 pentru fiecare 10 ml de soluție de carbol fuchsin-carbol. Aceleași rezultate au fost obținute.

Aplicații

Colorația sporilor oferă informații foarte valoroase și utile pentru identificarea agentului patogen, deoarece prezența, forma sa, localizarea în interiorul bacilului și capacitatea de a deforma sau nu celula vegetativă sunt date care pot ghida specia implicat într-un anumit gen.

În acest context, merită spus că sporii pot fi rotunzi sau ovali, pot fi localizați în centru sau, de asemenea, într-o poziție paracentrală, subminală sau terminală.

Diagrama formei și poziției endosporelor și expoarelor

Exemple

- Clostridium difficile formează o sporă ovală într-o poziție terminală care deformează bacilul.

- Sporul Clostridium tertium este oval, nu deformează bacilul și este situat la nivelul terminalului.

- Endosforul Clostridium tetani este terminal și deformează bacilul, dând aspectul unui tambur.

- Sporii Clostridium botulinum, C. histolyticum, C. novy și C. septicum sunt ovali rotunzi sau subterminali și deformează bacilul.

- Endosporul Clostridium sordelli este situat în poziția centrală, cu o ușoară deformare.

Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosticul microbiologic. (Ediția a 5-a). Argentina, Editorial Panamericana SA

Referințe

1. Hayama M, Oana K, Kozakai T, Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakami Y. Propunere de tehnică simplificată pentru colorarea sporilor bacteriene fără aplicarea căldurii - modificarea cu succes a metodei Moeller. Eur J Med Res. 2007; 16 12 (8): 356-9.
2. Colaboratorii Wikipedia. Pata Moeller. Wikipedia, enciclopedia gratuită. 3 noiembrie 2018, 03:28 UTC. Disponibil la adresa: en.wikipedia.org
3. Pérez R, Juárez M, Rodríguez (2011). Manual de laborator pentru tehnici microbiologice. Departamentul de Științe de Bază Academia de Microbiologie. Institutul Politehnic Național.
4. „Endosporilor.“ Wikipedia, enciclopedia gratuită. 25 Feb 2018, 10:20 UTC. 10 ian 2019, 02:42: en.wikipedia.org
5. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J și colaboratori. (2006). Personalul muncii al comunității autonome din Extremadura. Agenda specifică Volumul IV. Editorial MAD. Sevilla-Spania, pp. 211-212.
6. Silva M, García M, Corrales J, Ponce E. (2006). Tehnician specializat de laborator, Serviciul de Sănătate Galician (SERGAS). Volumul specific al agendei de subiect 2. Editorial MAD. Sevilla-Spania, pp. 79-80.
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosticul microbiologic. (Ediția a 5-a). Argentina, Editorial Panamericana SA
8. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Diagnostic microbiologic Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana SA