FROTIU BACTERIAN: CARACTERISTICI ȘI PREPARARE - BIOLOGIE - 2025

Frotiu bacterian este o peliculă subțire frotiu dintr - o suspensie de microorganisme bacteriene , care se face pe o placă de sticlă transparentă sau diapozitive, pentru observare sub un microscop cu lumină.

Extensia sub formă de film se realizează pentru a separa pe cât posibil microorganismele, deoarece dacă sunt grupate, observația nu este clară.

Figura 1. Frotiu bacterian observat la un microscop electronic de scanare. Sursa: pixbay.com

În studiul culturilor bacteriene, tehnicile de preparare, fixare și colorare a frotiilor sunt utilizate pentru a le analiza mai bine. Datorită dimensiunii reduse a microorganismelor, utilizarea unui microscop optic este necesară pentru observarea lor.

Microscoape optice sunt instrumente esențiale pentru observarea frotei. Acestea folosesc lentile optice și lumină care permit vizualizarea probelor cu mărire ridicată.

În general, celulele vii nu au structuri colorate în mare parte, văzute cu microscopul luminos, sunt mostre incolore, transparente și prezintă un contrast intern foarte mic și cu mediul lor.

Observația cu un microscop simplu de lumină de câmp luminos, fără utilizarea tehnicilor auxiliare de colorare, este foarte limitată și este utilizată doar în unele cazuri, cum ar fi în observarea mișcării microorganismelor.

Pentru o observare optimă a microorganismelor, trebuie să existe un echilibru între contrast și rezoluție. Detaliile celulare nu pot fi văzute la microscop, chiar și cu rezoluție înaltă; Folosirea coloranților este necesară prin tehnici de colorare, care oferă contrast pentru observare.

Caracteristicile unui frotiu bacterian de bună calitate

Contrast excelent

Pentru a obține un contrast excelent, există microscoape sofisticate numite microscopuri de contrast de fază, microscopuri de interferență diferențială și microscopuri de câmp întunecat. Acest tip de microscop este utilizat pentru a observa structuri bacteriene, cum ar fi teci și filamente, printre altele.

Colorarea este o tehnică simplă pentru a crește contrastul care se obține cu un microscop luminos. În această tehnică se pot utiliza diferite pete, care îmbunătățesc semnificativ observația microscopică.

Petele sunt efectuate direct pe frotiuri sau extensii ale suspensiilor de microorganisme de pe lamele, uscate anterior și fixate.

O soluție bună

Fixarea este o tehnică folosită pentru conservarea structurilor celulare; provoacă inactivarea microorganismelor și adeziunea la sticla diapozitivului. Există diferite tratamente de fixare: fixarea căldurii și fixarea chimică.

Fixarea căldurii

Aceasta este cea mai utilizată metodă pentru observarea frotiurilor bacteriene. Tehnica constă în trecerea suspensiei bacteriene a frotiei prin flacăra unei brichete. Această tehnică este capabilă să păstreze morfologia externă a bacteriilor, dar le distruge structurile interne.

Fixarea chimică

Fixarea chimică folosește substanțe chimice de conservare, cum ar fi formaldehidă sau formalină, etanol și acid acetic, printre altele. Avantajul utilizării agenților de fixare chimici este că se realizează conservarea structurilor celulare interne ale microorganismelor.

Figura 2. Frotiu de sânge. Sursa: Bobjgalindo, de la Wikimedia Commons

O colorare bună

Cele mai frecvente proceduri pentru colorarea unui frotiu uscat și fixat anterior sunt colorarea pozitivă sau simplă, colorarea diferențială și colorarea negativă. Există, de asemenea, tehnici speciale pentru colorarea unor structuri celulare particulare (capsulă, spor, flagel).

Colorarea pozitivă sau colorarea simplă

Colorarea pozitivă sau simplă este cea mai utilizată tehnică de colorare a frotiilor. Folosește coloranți care au capacitatea de a se lega de anumite structuri microbiene, permițându-le să fie observate la microscop.

Acești coloranți au grupe cromofore (porțiune colorată) în structura lor chimică, cu legături duble alternante și legături unice (conjugare). La rândul lor, aceste legături pot stabili legături ionice sau covalente cu unele structuri celulare.

Coloranții folosiți în colorarea pozitivă sau simplă sunt în mare parte derivați chimici ai anilinei (săruri organice colorate).

Pe de altă parte, printre coloranți putem găsi unii cu un pH de bază și alții cu un pH acid.

Coloranți de bază

În coloranții de bază, grupul de cromofori are o sarcină electrică pozitivă. Marea majoritate a microorganismelor procariote au un pH intern neutru, iar suprafața celulară este încărcată negativ. Prin această interacțiune electrostatică, cromoforul se leagă de celulă și o colora.

Exemple de coloranți de bază sunt albastru de metilen, violet de cristal, verde malacit, fuscină de bază, safranină, printre altele.

Vopsele acide

În coloranții acide, grupul cromofor are o sarcină electrică negativă. Acestea sunt utilizate pentru a colora proteinele cu grupări amino încărcate pozitiv. Exemple de coloranți acțiuni sunt fuscina acidă, trandafirul Bengal, roșu Congo și eozina.

Colorarea diferențială

Tehnica de colorare diferențială constă în aplicarea a doi coloranți de culoare sau intensitate diferită, pentru a distinge sub microscop microorganisme diferite. Pata Gram și pata de rezistență la acid și alcool sunt cele mai frecvent utilizate pete diferențiale în bacteriologie.

Pata Gram este folosită ca test preliminar pentru a cunoaște forma, dimensiunea, gruparea celulelor, precum și tipul de perete celular. Folosind testul de colorare Gram, bacteriile peretelui celular sunt clasificate în bacterii Gram pozitive și bacterii Gram negative.

Colorarea negativă

În această tehnică se folosesc coloranți chimici care nu pătrund în interiorul celulei, dar fac ca mediul în care microorganismele să apară ca fundal negru.

În tehnica de colorare negativă, frotiul este obținut dintr-o picătură de cerneală din India sau suspensie de nigrosină, care după ce a permis uscarea la temperatura camerei formează o peliculă opacă la trecerea luminii. În acest fel, microorganismele apar ca forme strălucitoare pe un fundal întunecat.

preparare

A. Frotiu

1.- Spălați bine lamelele, uscați-le cu hârtie absorbantă și etichetați-le. Eticheta trebuie să indice conținutul preparatului, data și numele persoanei care l-a prelucrat.

2.- Aprindeți bricheta și sterilizați bucla de inoculare în flacără până la roșu aprins.

3.- Lasă mânerul să se răcească.

4.- Luați tubul de cultură bacteriană, scoateți capacul și treceți rapid gura tubului lângă flacăra arzătorului (flacără).

5.- Introduceți bucla de inoculare în tubul care conține cultura bacteriană și luați proba.

6.- Dacă cultura se află în mediu lichid, așezați eșantionul prelevat cu mânerul în centrul toboganului și întindeți-l cu atenție într-un cerc cu diametrul de aproximativ 2 cm.

7.- Sterilizați din nou bucla de inoculare.

8.- Lăsați frotiul să se usuce în aer.

9.- Repetați pașii de la 3 la 8 de trei ori.

10.- Dacă cultura se află într-un mediu solid, trebuie să se plaseze în prealabil o picătură de apă distilată pe lamelă. Acest lucru este realizat pentru a amesteca un mic eșantion de cultură prelevat cu bucla de inoculare, așa cum este indicat în etapele 2 - 5 (condiții aseptice).

11.- Întindeți proba diluată cu picătură de apă pe lamelă și repetați de trei ori.

B. Fixarea

1.- Adăugați două picături de metanol sau etanol absolut în frotiile uscate - din culturi în mediu lichid -.

2.- Permite uscarea aerului departe de brichetă.

3.- Dacă frotiul provine dintr-o cultură pe mediu solid, frotiul uscat este fixat cu căldură, trecându-l rapid de 2 până la 3 ori prin partea cea mai fierbinte a flăcării mai ușoare.

4.- Atingeți partea inferioară a frotiei cu partea dorsală a mâinii stângi (pentru stângaci; în caz contrar, folosiți mâna dreaptă) și verificați dacă este rece.

C. Colorarea simplă

1.- Adăugați 2 picături din pata selectată la frotiu și lăsați să acționeze pentru timpul necesar în protocoalele specifice pentru fiecare pată (în general între 1 și 5 minute).

2.- Unele pete necesită utilizarea căldurii pentru activarea lor, caz în care trebuie să fii foarte atent când încălziți toboganul în flacăra mai ușoară (manipulați-l cu penseta și evitați fierberea). Supraîncălzirea frotiei poate distruge celulele care trebuie observate.

3.- Îndepărtați excesul de coloranți prin spălarea cu apă distilată dintr-un pichet. Îndepărtați apa de spălare atingând ușor diapozitivul de pe marginea sa, înclinat pe masa de lucru.

4.- Permite uscarea aerului.

5.- În funcție de tipul de observație, se folosește sau nu în acest stadiu un înveliș. Capacul protejează și păstrează frotiul. Dacă în această etapă se face o observație de imersiune în ulei, nu se folosesc niște copertine, dar frotiul nu poate fi păstrat.

D. Conservarea definitivă a frotiei

1.- Introduceți frotiul succesiv în fiecare dintre soluțiile indicate mai jos, timp de cel puțin 5 minute. Scopul acestor „băi” este de a deshidrata complet frotiul. Fiecare reactiv trebuie scurs bine înainte de a introduce frotiul în următoarea baie.

Ordinea băilor de deshidratare este următoarea:

1. Etanol 70%
2. Etanol 95%
3. Acetonă pură
4. Acetonă -xilol 1: 1 amestec
5. xilol

Apoi lăsați să se usuce.

2.- Montați capacul, de preferință 22 × 22 mm, folosind balsamul Canada sau alt mediu de montare.

Referințe

1. Briggs, G. (1965). Factorii cauzali în accidente și infecții de laborator microbiologic. Laboratoare biologice ale armatei americane Fort Detrick.
2. Cappucino, JG și Welch, CT (2017). Microbiologie: manual de laborator. Pearson.
3. Holt, JG Editor. (1977). Manualul Bergey mai scurt de Bacteriologie determinantă. Al 8- ^lea Baltimore: Williams și Wilkins Co.
4. Johnson, TR și cazul; CL (2018). Experimente de laborator în microbiologie. Pearson.
5. Tille, P. (2017). Microbiologie diagnostică. 14 ^th St. Louis, USA: Elsiever, Inc.