ENZIME DE RESTRICȚIE: FUNCȚII, TIPURI ȘI EXEMPLE - BIOLOGIE - 2025

De enzime de restricție sunt endonucleaze utilizate de anumite Archaea și bacterii pentru a inhiba sau „restricționează“ răspândirea virușilor în interiorul. Sunt frecvente în special în bacterii și fac parte din sistemul lor de apărare împotriva ADN-ului străin cunoscut sub numele de sistemul de restricție / modificare.

Aceste enzime catalizează clivajul ADN-ului cu bandă dublă în anumite locații, reproductibil și fără utilizarea de energie suplimentară. Majoritatea necesită prezența cofactorilor cum ar fi magneziul sau alți cationi divalenți, deși unii necesită și ATP sau S-adenosil metionină.

Schema de reacție a enzimei de restricție HindIII (Sursa: Helixitta prin Wikimedia Commons)

Endonucleazele de restricție au fost descoperite în 1978 de Daniel Nathans, Arber Werner și Hamilton Smith, care au primit premiul Nobel pentru medicină pentru descoperirea lor. Numele lor provine, în general, de la organismul în care sunt observate pentru prima dată.

Astfel de enzime sunt utilizate pe scară largă în dezvoltarea metodelor de donare a ADN-ului și a altor strategii de biologie moleculară și inginerie genetică. Caracteristicile lor specifice de recunoaștere a secvenței și capacitatea de a tăia secvențe apropiate de site-urile de recunoaștere, fac din ele instrumente puternice în experimentarea genetică.

Fragmente generate de enzimele de restricție care au acționat asupra unei anumite molecule de ADN pot fi utilizate pentru a recrea o „hartă” a moleculei originale prin utilizarea informațiilor despre siturile în care enzima a tăiat ADN-ul.

Unele enzime de restricție pot avea același loc de recunoaștere pe ADN, dar nu îl reduc în mod necesar în același mod. Astfel, există enzime care taie capetele sfărâmate și enzimele care taie lăsând capetele coezive, care au aplicații diferite în biologia moleculară.

În prezent, există sute de enzime de restricție disponibile în comerț, oferite de diferite case comerciale; Aceste enzime funcționează ca foarfece moleculare „personalizate” în scopuri diferite.

Caracteristici

Enzimele de restricție îndeplinesc funcția opusă polimerazelor, deoarece hidrolizează sau rup legătura ester din legătura fosfodiester între nucleotidele adiacente dintr-un lanț de nucleotide.

În biologia moleculară și inginerie genetică sunt instrumente utilizate pe scară largă pentru construcția vectorilor de expresie și clonare, precum și pentru identificarea secvențelor specifice. De asemenea, sunt utile pentru construcția genomului recombinant și au un potențial biotehnologic mare.

Progresele recente în terapia genică fac uz actual de enzime de restricție pentru introducerea anumitor gene în vectori care sunt vehicule pentru transportul unor astfel de gene în celule vii și care probabil au capacitatea de a se insera în genomul celular pentru a efectua schimbări permanente.

Mecanism de acțiune

Enzimele de restricție pot cataliza clivajul ADN-ului cu bandă dublă, deși unele sunt capabile să recunoască secvențele ADN-ului cu o singură bandă și chiar ARN-ul. Tăierea are loc după recunoașterea secvențelor.

Mecanismul de acțiune constă în hidroliza legăturii fosfodiester între o grupare fosfat și o dezoxiriboză în scheletul fiecărei catene ADN. Multe dintre enzime sunt capabile să taie pe același loc pe care îl recunosc, în timp ce altele taie între 5 și 9 perechi de baze înainte sau după aceasta.

În mod normal, aceste enzime sunt tăiate la capătul 5 'al grupei fosfat, dând naștere la fragmente de ADN cu un capăt 5' fosforil și un capăt 3 'hidroxil terminal.

Deoarece proteinele nu intră în contact direct cu situsul de recunoaștere în ADN, ele trebuie translocate succesiv până la obținerea locului specific, poate prin intermediul unor mecanisme de „alunecare” pe catenele ADN.

În timpul clivajului enzimatic, legătura fosfodiesteră a fiecăreia dintre firele ADN este poziționată în unul dintre situsurile active ale enzimelor de restricție. Când enzima părăsește locul de recunoaștere și clivaj, o face prin asociații tranzitorii nespecifice.

Tipuri

Cinci tipuri de enzime de restricție sunt cunoscute în prezent. Iată o scurtă descriere a fiecăruia:

Enzime de restricție de tip I

Aceste enzime sunt proteine ​​pentamerice mari cu trei subunități, una pentru restricție, una pentru metilare și alta pentru recunoașterea secvenței în ADN. Aceste endonucleaze sunt proteine ​​multifuncționale capabile să catalizeze reacții de restricție și modificare, au activitate ATPază și, de asemenea, topoizomeraza ADN.

Enzimele de acest tip au fost primele endonucleaze descoperite, au fost purificate pentru prima dată în anii 1960 și au fost studiate în profunzime de atunci.

Enzimele de tip I nu sunt utilizate pe scară largă ca instrument biotehnologic, deoarece situl de clivaj poate fi la o distanță variabilă de până la 1.000 de perechi de baze față de locul de recunoaștere, ceea ce le face nesigure în ceea ce privește reproductibilitatea experimentală.

Enzime de restricție de tip II

Sunt enzime compuse din homodimeri sau tetrameri care taie ADN-ul la situsuri definite între 4 și 8 bp lungime. Aceste site-uri de clivaj sunt de obicei palindromice, adică recunosc secvențe care sunt citite în același mod în ambele direcții.

Multe dintre enzimele de restricție de tip II din bacterii taie ADN-ul atunci când își recunosc caracterul străin, deoarece nu are modificările tipice pe care ar trebui să le aibă propriul ADN.

Acestea sunt cele mai simple enzime de restricție, întrucât nu necesită niciun cofactor în afară de magneziu (Mg +) pentru a recunoaște și tăia secvențele de ADN.

Precizia enzimelor de restricție de tip II în recunoașterea și tăierea secvențelor simple în ADN în poziții precise le face una dintre cele mai utilizate și indispensabile în majoritatea ramurilor biologiei moleculare.

În cadrul enzimelor de restricție de tip II există mai multe subclase clasificate în funcție de anumite proprietăți care sunt unice pentru fiecare. Clasificarea acestor enzime se face prin adăugarea de litere din alfabet, de la A la Z, urmând numele enzimei.

Unele dintre subclase cele mai cunoscute pentru utilitatea lor sunt:

Subclasa IIA

Sunt dimeri de subunități diferite. Recunosc secvențe asimetrice și sunt utilizate ca precursori ideali pentru generarea enzimelor de tăiere.

Subclasa IIB

Sunt alcătuite dintr-unul sau mai mulți dimeri și taie ADN pe ambele părți ale secvenței de recunoaștere. Au tăiat ambele fire de ADN un interval de perechi de baze înaintea locului de recunoaștere.

Subclasa IIC

Enzimele de acest tip sunt polipeptide cu funcții de divizare și modificare a catene de ADN. Aceste enzime taie ambele catenă asimetric.

Subclasa IIE

Enzimele acestei subclase sunt cele mai utilizate în inginerie genetică. Au un situs catalitic și necesită, în general, un efect alosteric. Aceste enzime trebuie să interacționeze cu două copii ale secvenței de recunoaștere pentru a efectua clivaj eficient. În cadrul acestei subclase sunt enzimele EcoRII și EcoRI.

Enzime de restricție de tip III

Endonucleazele de restricție de tip III sunt compuse numai din două subunități, una este responsabilă pentru recunoașterea și modificarea ADN-ului, în timp ce cealaltă este responsabilă pentru clivarea secvenței.

Aceste enzime necesită doi cofactori pentru funcția lor: ATP și magneziu. Enzimele de restricție de acest tip posedă două situsuri de recunoaștere asimetrice, translocă ADN-ul într-o manieră dependentă de ATP și îl taie între 20-30 bp adiacent sitului de recunoaștere.

Enzime de restricție de tip IV

Enzimele de tip IV sunt ușor de identificat, deoarece taie ADN-ul cu semne de metilare, sunt formate din mai multe subunități diferite care sunt responsabile de recunoașterea și tăierea secvenței ADN-ului. Aceste enzime folosesc GTP și magneziu divalent ca cofactori.

Siturile de clivaj specifice includ catene de nucleotide cu reziduuri de citozină metilate sau hidroximetilate pe una sau ambele catene de acizi nucleici.

Enzime de restricție de tip V

Această clasificare grupează enzimele tip CRISPER-Cas, care identifică și taie secvențe specifice de ADN de la organisme invadatoare. Enzimele Cas utilizează o suită de ARN ghid sintetizat CRISPER pentru a recunoaște și a ataca organismele invadatoare.

Enzimele clasificate ca tip V sunt polipeptide structurate după enzime de tip I, II și II. Ele pot tăia secțiuni ale ADN-ului de aproape orice organism și cu o gamă largă de lungime. Flexibilitatea și ușurința lor de utilizare fac din aceste enzime unul dintre cele mai utilizate instrumente în inginerie genetică astăzi, împreună cu enzimele de tip II.

Exemple

Enzimele de restricție au fost utilizate pentru detectarea polimorfismelor ADN, în special în studiile genetice ale populației și studiile evolutive folosind ADN mitocondrial, pentru a obține informații despre ratele de substituții ale nucleotidelor.

În prezent, vectorii folosiți pentru transformarea bacteriilor în diverse scopuri posedă situri multiclonare unde se găsesc situri de recunoaștere a enzimelor cu restricții multiple.

Printre aceste enzime, cele mai populare sunt EcoRI, II, III, IV și V, obținute și descrise pentru prima dată de la E. coli; HindIII de la H. influenzae și BamHI de la B. amyloliquefaciens.

Referințe

1. Bickle, TA, & Kruger, DH (1993). Biologia restricției ADN-ului. Recenzii microbiologice, 57 (2), 434–450.
2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, DA, & Horvath, P. (2007). CRISPR oferă rezistență dobândită împotriva virușilor în procariote. Știință, 315 (martie), 1709-1713.
3. Goodsell, D. (2002). Perspectiva moleculară: Restricția Endonucleazelor. Fundamentele celulelor stem din medicina cancerului, 20, 190-1991.
4. Halford, SE (2001). Salt, sărituri și bucle prin enzime de restricție. Tranzacțiile societății biochimice, 29, 363-373.
5. Jeltsch, A. (2003). Menținerea identității speciilor și controlul specializării bacteriilor: o nouă funcție pentru sistemele de restricție / modificare? Gene, 317, 13-16.
6. Krebs, J., Goldstein, E., & Kilpatrick, S. (2018). Genele lui Lewin XII (12 ed.). Burlington, Massachusetts: Jones & Bartlett Learning.
7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N., … Ea, Q. (2015). Exploatarea sistemelor CRISPR-Cas de tip I și de tip III pentru editare a genomului. Cercetarea acizilor nucleici, 1–12.
8. Loenen, WAM, Dryden, DTF, Raleigh, EA, & Wilson, GG (2013). Enzimele de restricție de tip I și rudele lor. Cercetarea acizilor nucleici, 1–25.
9. Nathans, D., & Smith, HO (1975). Restricție Endonucleazele în analiza și restructurarea moleculelor de ADN. Annu. Rev. Biochem. , 273–293.
10. Nei, M., & Tajima, F. (1981). Dna polimorfism detectabil prin endonucleaze de restricție. Genetică, 145-163.
11. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Științele vieții celulare și moleculare Endonucleaze de restricție de tip II: structură și mecanism. CMLS Cellular and Molecular Life Sciences, 62, 685–707.
12. Roberts, R. (2005). Cum au devenit enzimele de restricție caile de lucru ale biologiei moleculare. PNAS, 102 (17), 5905–5908.
13. Roberts, RJ, & Murray, K. (1976). Endonucleazele de restricție. Recenzii critice în biochimie, (noiembrie), 123-164.
14. Stoddard, BL (2005). Structura și funcționarea endonucleazei de acasă. Recenzii trimestriale de biofizică, 1-47.
15. Tock, MR, & Dryden, DTF (2005). Biologia restricției și anti-restricției. Opinia curentă în microbiologie, 8, 466-472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
16. Wilson, GG, & Murray, NE (1991). Sisteme de restricție și modificare. Annu. Rev. Genet. , 25, 585-627.
17. Wu, Z., & Mou, K. (2016). Informații genomice despre virulența Campylobacter jejuni și genetica populației. Infec. Dis. Transl. Med., 2 (3), 109–119.
18. Yuan, R. (1981). Structura și mecanismul de restricție multifuncțională Endonucleaze. Annu. Rev. Biochem. , 50, 285-315.