AGAR DE SÂNGE: RAȚIONAMENT, UTILIZĂRI ȘI PREPARARE - BIOLOGIE - 2025

Agarul de sânge este un mediu de cultură solid îmbogățit diferențială dar neselectiv. Este utilizat pentru recuperarea și creșterea unei mari varietăți de microorganisme din probe clinice sau pentru subculturi.

Agarul de sânge clasic ar trebui inclus pentru semănarea majorității probelor clinice primite în laborator; cu excepția probelor de scaun unde nu este utilă, cu excepția cazului în care sunt preparate cu anumite modificări.

Placă de agar de sânge

Acest mediu de cultură constă practic dintr-un agar bazic îmbogățit și 5% sânge. Baza de agar poate varia în funcție de necesități, dar va fi compusă în principal din peptone, aminoacizi, vitamine, extract de carne, clorură de sodiu, agar, printre altele.

În ceea ce privește sângele, în mod normal este necesar să aveți contact cu un vivariu pentru a obține sânge de la animale, cum ar fi oile, iepurele sau calul. Cu toate acestea, acest lucru nu este întotdeauna posibil și sângele uman este uneori utilizat.

Mediul de agar de sânge poate fi preparat în laborator sau poate fi achiziționat gata fabricat de la companii dedicate. Prepararea acestui mediu este una dintre cele mai delicate, orice neglijență în prepararea sa va duce la un lot contaminat.

De aceea, trebuie luate toate măsurile de precauție posibile, iar la final trebuie efectuat un control al calității prin incubarea la 37 ° C a unei plăci pentru fiecare 100 preparate.

Bază

Staphylococcus aureus cultivat pe agar de sânge. Nathan Reading pe Flickr Nathan R. pe Twitter, prin Wikimedia Commons S-a menționat deja că agarul de sânge are caracteristica de a fi un mediu îmbogățit, diferențiat și neselectiv. Baza pentru fiecare dintre aceste proprietăți este explicată mai jos.

Agarul de sânge este un mediu îmbogățit, deoarece conține 5-10% sânge pe o bază de agar ca principal aditiv. Ambii compuși conțin mulți nutrienți și această proprietate permite majorității bacteriilor cultivabile să crească în el.

Că creșterea are loc fără restricții; din acest motiv este neselectivă. Cu toate acestea, dacă se adaugă compuși la acest mediu care împiedică creșterea unor microorganisme și favorizează pe al altora, acesta devine selectiv. Acesta este cazul dacă se adaugă anumite tipuri de antibiotice sau antifungice.

De asemenea, agarul de sânge este un mediu diferențial, deoarece permite distingerea a 3 tipuri de bacterii: beta-hemolitice, alfa-hemolitice și gamma-hemolitice.

Beta-hemolitice sunt cele care au capacitatea de a liza complet sau de a descompune globulele roșii din sânge, formând un halou clar în jurul coloniilor, de aceea produc ß sau ß-hemoliză, iar microorganismele sunt numite ß-hemolitice.

Exemple de bacterii ß-hemolitice sunt Streptococcus pyogenes și Streptococcus agalactiae.

Agenții alfa-hemolitici sunt cei care realizează hemoliza parțială, unde hemoglobina este oxidată la methemoglobină, generând o colorație verzuie în jurul coloniilor. Acest fenomen este cunoscut sub numele de α sau α-hemoliză și bacteriile sunt clasificate ca α-hemolitice.

Exemple de bacterii α-hemolitice sunt Streptococcus pneumoniae și Streptococcus din grupul viridans.

În cele din urmă, există așa-numitele bacterii gamma-hemolitice sau non-hemolitice. Acestea cresc pe agar fără a genera modificări asupra acestuia, efect cunoscut sub numele de γ-hemoliză, iar microorganismele sunt γ-hemolitice.

Exemplu de bacterii γ-hemolitice: unele tulpini de Streptococcus din grupul D (Streptococcus bovis și Enterococcus faecalis).

Aplicații

Mediul de cultură de agar din sânge este unul dintre cele mai utilizate în laboratorul de microbiologie.

Printre microorganismele capabile să crească în mediul agar de sânge se numără: bacterii aerobe, facultative, microaerofile, anaerobe, Gram pozitive sau Gram negative, bacterii cu creștere rapidă sau cu creștere lentă.

Unele bacterii solicitante din punct de vedere nutrițional sau fastidios cresc, precum și ciuperci și drojdii. De asemenea, este util pentru subculturarea sau reactivarea tulpinilor care sunt metabolizate foarte slab.

Cu toate acestea, alegerea tipului de sânge și a agarului bazic va varia în funcție de microorganismul probabil suspectat de recuperare și de utilizarea la care este utilizată placa (cultură sau antibiogramă).

Alegerea tipului de sânge

Sângele poate fi miel, iepure, cal sau om.

Cel mai recomandat este sângele de miel, cu unele excepții. De exemplu, pentru a izola speciile Haemophilus, unde sângele recomandat este sângele de cal sau iepure, deoarece sângele de miel conține enzime care inhibă factorul V.

Cel mai puțin recomandat este omul, însă este cel mai folosit, poate pentru că este cel mai ușor de obținut.

Sângele trebuie defibrinat, obținut fără niciun tip de aditiv și de la animale sănătoase. Pentru utilizarea sângelui uman, trebuie luați în considerare mai mulți factori:

Dacă sângele provine de la indivizi care au avut infecții bacteriene, vor avea anticorpi specifici. În aceste condiții, creșterea unor bacterii este probabil să fie inhibată.

Dacă este obținut din banca de sânge, conține citrat și anumite bacterii pot să nu crească în prezența sa. Pe de altă parte, dacă sângele provine de la pacienți care iau antibiotice, creșterea bacteriilor sensibile poate fi inhibată.

Și dacă sângele provine de la o persoană diabetică, excesul de glucoză interferează cu dezvoltarea corectă a modelelor de hemoliză.

Alegerea tipului de agar de bază

Agarul de bază utilizat pentru prepararea agarului de sânge poate fi foarte larg. Printre acestea se numără: agar de nutrienți, agar de infuzie a inimii creierului, agar de soia tripticază, agar Müeller Hinton, agar Thayer Martin, agar Columbia, agar Brucella, agar Campylobacter etc.

Utilizări de agar de sânge în funcție de mediul de bază utilizat pentru prepararea acestuia

Agar nutritiv

Această bază este cea mai puțin folosită, deoarece va crește în principal bacteriile neexigente, cum ar fi bacilii enterici, Pseudomonas sp, S. aureus, Bacillus sp, printre altele. Nu se recomandă izolarea Streptococcus.

Agar de infuzie a inimii cerebrale (BHI)

Este unul dintre cele mai utilizate ca bază pentru agarul din sânge, deoarece conține nutrienții necesari pentru creșterea majorității bacteriilor, inclusiv Streptococcus sp și alte bacterii solicitante. Deși nu este potrivit pentru observarea tiparelor de hemoliză.

Sângele de miel este folosit în general cu această bază.

De asemenea, pot fi preparate variante de agar din sânge, unde se adaugă alți compuși pentru a izola anumite microorganisme. De exemplu, Agar cu infuzie cerebrală suplimentată cu sânge de iepure, cistină și glucoză poate fi utilizată pentru a izola Francisella tularensis.

În timp ce, cu telurină de cistină, este utilă pentru izolarea Corynebacterium diphteriae. Se poate folosi sânge uman sau miel.

Cu prima beta-hemoliză va fi văzută ca un halou îngust, în timp ce cu a doua, halo va fi mult mai largă.

De asemenea, această bază, împreună cu bacitracină, amidon de porumb, sânge de cal și alte suplimente de îmbogățire (IsoVitaleX), este utilizată pentru izolarea genului Haemophilus sp din probele respiratorii.

De asemenea, dacă se adaugă combinația de antibiotice cloramfenicol - gentamicină sau penicilină - streptomicină cu sânge de cal, este ideală pentru izolarea ciupercilor patogene solicitante, chiar și cu un randament mai mare decât agoura de glucoză Sabouraud. Este util mai ales în izolarea Histoplasma capsulatum.

Agar de soia Trypticase

Această bază este cea mai recomandată pentru o mai bună observare a modelului de hemoliză și pentru efectuarea testelor de diagnostic, cum ar fi taxonii optochinini și bacitracina. Agarul clasic de sânge este folosit de rutină.

Cu această bază puteți pregăti și agarul special de sânge pentru Corynebacterium diphteriae, cu telurină de cistină și sânge de miel .

De asemenea, combinația acestui agar cu sângele de miel, plus kanamicina-vancomicina este ideală pentru creșterea anaerobilor, în special Bacteroides sp.

Müeller Hinton agar

Această bază completată cu sânge este utilizată pentru a realiza antibiograma microorganismelor fastidioase, cum ar fi Streptococcus sp.

De asemenea, este util pentru izolarea bacteriilor precum Legionella pneumophila.

Thayer Martin Agar

Acest mediu este ideal ca bază pentru agar de sânge atunci când se suspectează genul Neisseria, în special Neisseria meningitidis, deoarece N. gonorrhoeae nu crește pe agar sanguin.

Este, de asemenea, utilizat pentru a testa sensibilitatea la Neisseria meningitidis.

Agar Columbia

Această bază este excelentă pentru semănarea specimenelor de biopsie gastrică pentru Helicobacter pylori.

Mediul este preparat adăugând 7% sânge de miel defibrinat cu antibiotice (vancomicină, trimetoprim, amfotericină B și cefsulodină) pentru a restricționa creșterea altor tipuri de bacterii care pot fi prezente.

Aceeași bază completată cu sânge uman sau de miel, acid nalidixic și colistină este utilă pentru izolarea Gardnerella vaginalis. Este ideal și pentru evaluarea susceptibilității antimicrobiene la antibiotice ale aceluiași microorganism.

În plus, este utilizat pentru prepararea agarului de sânge pentru cultivarea anaerobilor, adăugând aminoglicozide și vancomicină.

Această bază permite observarea corectă a modelelor de hemoliză.

Brucella agar

Acest mediu utilizat ca bază pentru agar de sânge împreună cu adăugarea de vitamina K este ideal pentru cultivarea bacteriilor anaerobe. În acest caz, se recomandă utilizarea sângelui de miel.

Agar de Campylobacter

Agarul Campylobacter completat cu 5% sânge de oaie și 5 antibiotice (cefalotină, amfotericină B, trimetoprim, polimixină B și vancomicină), este mediul utilizat pentru a izola Campylobacter jejuni la probele de scaun.

preparare

Fiecare casă comercială aduce instrucțiunile pentru prepararea unui litru de mediu de cultură pe spatele containerului. Se pot face calcule corespunzătoare pentru a pregăti cantitatea dorită, în funcție de agarul de bază selectat.

Se cântărește și se dizolvă

Agarul de bază este deshidratat (pulbere), de aceea trebuie dizolvat în apă distilată ajustat la pH 7,3.

Cantitatea indicată de agarul de bază ales se cântărește și se dizolvă în cantitatea corespunzătoare de apă într-un balon, apoi se încălzește la foc moderat și se amestecă cu mișcări rotative până când se dizolvă toată pulberea.

Steriliza

Odată dizolvat, sterilizați într-o autoclavă la 121 ° C timp de 20 de minute.

Agregat de sânge

La părăsirea autoclavei, vasul este lăsat să se răcească până când temperatura este cuprinsă între 40 și 50 ° C; Este o temperatură pe care pielea umană o susține și, în același timp, agarul nu s-a solidificat încă.

Pentru a face acest lucru, flaconul este atins cu mâna și dacă căldura este tolerabilă, este temperatura ideală pentru a adăuga cantitatea corespunzătoare de sânge defibrinat (50 ml pentru fiecare litru de agar). Amestecă ușor pentru a omogeniza.

Trecerea agregării de sânge este crucială, deoarece, dacă se face atunci când mediul este foarte cald, globulele roșii se vor descompune, iar mediul nu va fi folosit pentru a observa hemoliza.

Dacă se adaugă prea rece, se va aglomera, iar suprafața mediului nu va fi netedă pentru a permite notarea corectă.

Se toarnă în vasele Petri

Serviți în preparate Petri sterile imediat după omogenizarea sângelui. În fiecare vas Petri se toarnă aproximativ 20 ml. Această procedură se realizează într-o capotă cu flux laminar sau lângă arzător.

Când se servește agar de sânge în vasele Petri, nu trebuie să rămână bule de aer pe suprafața farfuriei. Dacă se întâmplă acest lucru, flacăra arzătorului Bunsen este trecută rapid peste placă pentru a le elimina.

Plăcile se lasă solidificate și păstrate într-un frigider (2-8 ° C) inversat până la utilizare. Înainte de a utiliza plăcile de agar de sânge, acestea trebuie să fie temperate (lăsate să atingă temperatura camerei) pentru a putea fi însămânțate.

Plăcile pregătite durează aproximativ 1 săptămână.

Referințe

1. Bayona M. Condiții microbiologice pentru cultura Helicobacter pylori. Rev Col Gastroenterol 2013; 28 (2): 94-99
2. García P, Paredes F, Fernández del Barrio M. (1994). Microbiologie clinică practică. Universitatea din Cadiz, ediția a II-a. Serviciul de publicații UCA
3. „Agar de sânge”. Wikipedia, enciclopedia gratuită. 10 Dec 2018, ora 14:55 UTC. 27 Dec 2018, 01:49 ro.wikipedia.org.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnostic microbiologic Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana SA
5. CEDIVET Laborator Centrul de Diagnostic Veterinar. Guatemala. Disponibil la adresa: trensa.com.
6. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosticul microbiologic. (Ediția a 5-a). Argentina, Editorial Panamericana SA