COLORAREA HEMATOXILINĂ-EOZINĂ: CARACTERISTICI, UTILIZĂRI, TEHNICI - CHIMIE - 2025

Hematoxilină - eozină este o tehnica de colorare folosind combinația de hematoxilină și eozină coloranți. Această pereche de coloranți face un duo perfect, întrucât hematoxilina acționează ca un colorant de bază, iar eozina este un colorant acid.

Desemnarea coloranților bazici sau acizi nu se referă la pH-ul pe care îl obțin în soluție, ci mai degrabă vorbește despre proporția prevalentă în ceea ce privește sarcinile anionice sau cationice pe care le dețin sau de localizarea grupului cromofor.

Hematoxilină - epiteliu coloanar colorat cu eozină (HE) Sursa: Todd Straus și Vladimir Osipov

În acest sens, hematoxilina este considerată un colorant bazic (cationic) și, prin urmare, are o afinitate pentru structurile acide, cum ar fi nucleul celulelor. În timp ce eozina, fiind un colorant acid (anionic), are o afinitate pentru structurile alcaline sau bazice, cum ar fi citoplasma celulară.

Din acest motiv, această combinație de coloranți este utilizată pe scară largă pentru colorarea țesuturilor, deoarece permite distingerea clară a nucleelor ​​și citoplasmelor. Nucleele sunt pete albastru închis sau violet și citoplasma roz.

Colorația hematoxilină-eozină este una dintre cele mai utilizate tehnici de colorare în domeniul histologiei și citologiei, datorită manipulării ușoare și a costurilor reduse. Este utilizat pentru vizualizarea celulelor, fibrelor nervoase groase și prezența anumitor microorganisme în țesuturi, cum ar fi: paraziți, ciuperci și bacterii, printre altele.

caracteristici

Hematoxylin

Hematoxilina este un colorant neutru. Cu toate acestea, componenta care asigură culoarea (cromoforul) este localizată în centrul cationic sau de bază al moleculei. De aici afinitatea sa pentru structurile acide. Formula sa chimică este C ₁₆ H ₁₄ O ₆ și denumirea științifică este 7,11b-dihidroindeno cromen 3, 4,6a, 9,10 (6 H) -pentol.

Pacă în principal nucleele celulelor, deoarece sunt foarte bogate în acizi nucleici. De asemenea, poate colora incluziuni citoplasmatice de origine virală.

Pentru ca hematoxilina să poată colora, trebuie să fie într-o stare oxidată și legată de un metal. Acesta din urmă va servi la fixarea țesutului, adică va acționa ca un mordant.

Atunci când hematoxilina este oxidată se numește hemateină. Oxidarea se realizează prin expunerea la oxigen (îmbătrânire) a reactivului sau prin substanțe care ajută la oxidarea acestuia (oxidarea chimică).

eosin

Eozina este un colorant care pătează roșu sau roz. Este insolubil în apă, deși există o versiune solubilă în apă. În general, eozina este preparată prin dizolvarea în alcool (95 ° etanol).

Petează citoplasmele, fibrele musculare, organele citoplasmatice și colagenul, dar nu pătează nucleele celulare. Acest lucru se datorează faptului că este încărcat negativ, prin urmare, are o afinitate pentru structurile încărcate pozitiv.

Există două tipuri de eozină „Y” și „B”. Eozina „Y” este cunoscută sub numele de eozină galbenă. Denumirea sa științifică este tetrabromo-fluoresceina, iar formula sa chimică este C ₂₀ H ₈ Br ₄ O ₅ .

Pe de altă parte, eozina "B" este numită uneori eritrosină albăstruie. Denumirea sa științifică este dibromodynitro-fluorescein și formula este C ₂₀ H ₈ Br ₂ N ₂ O ₉ . Ambele sunt foarte asemănătoare, iar diferența dintre utilizarea unuia sau celuilalt nu se observă cu adevărat. Cu toate acestea, cea mai populară este eozina „Y”.

Eosina are proprietatea de a distinge între o celulă vie și una moartă, întrucât este capabilă doar să traverseze membrana pentru a-și păstra citoplasma atunci când celulele sunt moarte, lăsând citoplasma celulei incoloră dacă rămâne în viață.

Aplicații

Colorarea fibrelor nervoase

Fibrele nervoase groase pot fi colorate și identificate cu hematoxilină-eozină. Cu toate acestea, nu este util pentru colorarea fibrelor nervoase subțiri, deoarece este necesară o colorare de argint pentru a vizualiza acestea din urmă.

Petele histologice ale secțiunii pielii

În colorarea stratului excitat al pielii, colorantul care acționează este eozina, deoarece la acest nivel celulele nu au un nucleu.

În stratul granular al pielii, hematoxilina pătrunde puternic granulele de keratohialină din interiorul celulelor granulelor. Dimpotrivă, stratul spinos al pielii este slab colorat cu hematoxilină, în timp ce stratul bazal sau germinal este destul de colorat.

Eozina colorează citoplasma tuturor celulelor și intensitatea culorii poate varia de la strat la strat.

Colorarea hematoxilină-eozină a probelor de scaun

Gómez și colab., În 2005 au demonstrat că colorarea hematoxilină-eozină a fost mai eficientă în identificarea cazurilor de amebioză datorată Entamoeba histolytica și Entamoeba dispar decât metoda de vizualizare proaspătă (soluție salină și lugol) la pacienții cu boală diareică acută.

S-a dovedit, de asemenea, că este foarte sensibil în detectarea eritrofagocitozei (amebe care au înghițit eritrocite).

Colorarea secțiunilor histologice pentru diagnosticul infecției

Walwyn et al., În 2004, au propus utilizarea unor pete histologice pentru a detecta microorganisme provocatoare de infecție.

Folosind colorarea hematoxilinei-eozinei, au putut vizualiza infecțiile cauzate de Clostridium, Actinomyces, spirillae sau Candida. De asemenea, au putut observa prezența parazitului Sarcoptes escabiei în secțiunile pielii și incluziunile virale prin citomegalovirus și herpes în secțiuni ale diferitelor țesuturi.

Tehnici

Pentru probele histologice

Colorarea secțiunii histologice parcurge o serie de pași. Primul lucru este obținerea secțiunii histologice. Acest lucru trebuie cerut pentru a obține ulterior tăieturile (ultra-fine) cu un microtom. Tehnica constă în următorii pași:

1-Eliminarea excesului de parafină : pentru aceasta puteți folosi xilol sau Heme-D, scufundați timp de 3-5 minute.

2-Rehidratarea eșantionului: aceasta se realizează prin scufundarea eșantionului în diferite concentrații de alcooli (etanol) în ordine descrescătoare (100 °, 90 °, 70 °). În toate cazurile timp de 7 minute.

3-Eliminarea excesului de alcool: pentru aceasta este scufundat în apă timp de 7 minute.

4-Colorare cu hematoxilină: proba este scufundată timp de 6-10 minute într-o tavă conținând hematoxilină. Timpul de expunere depinde de mărimea și grosimea eșantionului.

5-Eliminarea excesului de hematoxilină: se spală cu apă timp de 5 minute și apoi se realizează o trecere rapidă (10-20 secunde) prin alcool acid. Ulterior se spală cu apă din nou timp de 5 minute. Apoi este scufundat în etanol la 96 ° timp de 1 minut.

6-Colorare cu eozină: pentru aceasta, eșantionul este scufundat timp de 5 minute în tava cu eozină.

7-Deshidratarea eșantionului : pentru a face acest lucru, trece prin tăvile de alcool (etanol), dar de data aceasta în ordine crescătoare. (70 °, 90 °, 100 °). (Timp de 5 secunde, respectiv 5 secunde, respectiv 1 minut).

8-Clarificarea eșantionului : pentru aceasta, acesta este expus la xilol timp de 5-10 minute și uscat pentru a sigila definitiv cu balsamul din Canada sau cu alt material similar.

Pentru probe de scaun căutate

Un frotiu se face pe o lamelă cu scaunul pacientului și se fixează cu 80% alcool timp de 5 minute. Foaia este scufundată în hematoxilină timp de 5 minute și imediat spălată cu apă.

Ulterior, este scufundat rapid în alcool acid și apoi în apă cu amoniac. Se spală cu apă. Se colorează timp de 5 minute în eozină. Eșantionul este deshidratat așa cum se explică în stadiul tehnicii și în final se clătește cu xilen.

Pregătirea reactivilor

- Hematoxilină

Într-un litru de apă distilată se dizolvă 50 de grame de potasiu sau sulfat de aluminiu de amoniu. Când s-a dizolvat complet, se adaugă 1 gram de hematoxilină cristalizată. La dizolvarea completă, se adaugă 1 g de acid citric împreună cu 50 g de hidrat cloral și 0,2 g de iodat de sodiu.

Amestecul se fierbe timp de 5 minute, apoi se lasă la răcit și se filtrează pentru a îndepărta particulele solide care au rămas. Reactivul astfel preparat poate fi utilizat imediat.

- Eosin

Poate fi preparat cu o bază alcoolică sau cu o bază de apă.

Eozină alcoolică

În 100 ml de etanol la 95 ° dizolvați 0,5 grame de eozină "Y". Apoi adăugați câteva picături de acid acetic glacial.

Eozină apoasă 2%

În 1250 ml de apă distilată se dizolvă 25 de grame de eozină solubilă în apă "Y". Apoi adăugați câteva picături de acid acetic glacial.

Alcool acid

Măsurați 0,5 ml de acid clorhidric concentrat și completați până la 100 ml cu alcool absolut.

Apa de amoniac

Măsurați 0,5 ml de amoniac concentrat și completați până la 100 ml cu apă distilată.

Referințe

1. Navarrete, G. Histologia pielii. Rev Fac Med UNAM 2003; 46 (4): 130-133. Disponibil la: medigraphic.com
2. Gómez-Rivera N, Molina A, García M, Castillo J, Castillo J, García R, Fonseca I, Valenzuela O.
3. Identificarea Entamoeba histolytica / E. Dispar prin tehnica proaspătă de ameba față de colorarea sa cu hematoxilină-eozină în diaree acută. Rev Mex Pediatr 2005; 72 (3); 109-112. Disponibil la: medigraphic.com
4. Walwyn V, Iglesias M, Almarales M, Acosta N, Mera A, Cabrejas M. Utilitatea tehnicilor histologice pentru diagnosticarea infecției în epruvete anatomice. Rev Cub Med Mil, 2004; 33 (2). Disponibil la adresa: scielo.sld
5. Reactivi ITR PanReac AppliChem. Pata de hematoxilină-eozină. 2017, Spania. Disponibil la: itwreagents.com
6. Eozină. Wikipedia, enciclopedia gratuită. 7 nov 2018, 08:18 UTC. 4 august 2019, 22:13 en.wikipedia.org
7. „Hematoxilina.“ Wikipedia, enciclopedia gratuită. 3 mai 2019, ora 11:23 UTC. 4 august 2019, 22:48 wikipedia.org