ENDONUCLEAZE: FUNCȚII, TIPURI ȘI EXEMPLE - BIOLOGIE - 2025

Cele endonucleazele sunt enzime care taie legăturile fosfodiesterice situate în lanțul nucleotidelor. Siturile de restricție ale endonucleazei sunt foarte variate. Unele dintre aceste enzime taie ADN-ul (acidul dezoxiribonucleic, materialul nostru genetic) aproape oriunde, adică sunt nespecifice.

În schimb, există un alt grup de endonucleaze care sunt foarte specifice în regiune sau secvență care trebuie scindate. Acest grup de enzime este cunoscut sub numele de enzime de restricție și sunt foarte utile în biologia moleculară. În acest grup avem enzimele binecunoscute Bam HI, Eco RI și Alu I.

Endonucleazele au tăiat ADN-ul intern.
Sursa: pixabay.com

Spre deosebire de endonucleaze, există un alt tip de proteine ​​catalitice - exonucleazele - care sunt responsabile de ruperea legăturilor de fosfodiester la capătul lanțului.

Endonucleazele de restricție

Endonucleazele de restricție sau enzimele de restricție sunt proteine ​​catalitice care sunt responsabile de scindarea legăturilor fosfodiester din lanțul ADN în secvențe foarte specifice.

Aceste enzime pot fi achiziționate de la mai multe companii de biotehnologie și utilizarea lor este aproape esențială în cadrul tehnicilor actuale de manipulare a ADN-ului.

Endonucleazele de restricție sunt denumite folosind primele litere ale numelui științific binomial al organismului din care provin, urmate de tulpina (aceasta este opțională) și se termină cu grupul de enzime de restricție din care fac parte. De exemplu, Bam HI și Eco RI sunt endonucleaze utilizate pe scară largă.

Regiunea ADN pe care o recunoaște enzima se numește locul de restricție și este unică pentru fiecare endonuclează, deși mai multe enzime pot coincide la locurile de restricție. Acest site constă, în general, dintr-o secvență palindromică scurtă, cu lungimea de 4 până la 6 perechi de baze, cum ar fi AGCT (pentru Alu I) și GAATTC pentru Eco RI.

Secvențele palindromice sunt secvențe care, deși sunt citite în direcția 5 'la 3' sau 3 'la 5', sunt identice. De exemplu, pentru cazul Eco RI, secvența palindromică este: GAATTC și CTTAAG.

Funcțiile și aplicațiile endonuclelor de restricție

Din fericire pentru biologii moleculari, bacteriile au dezvoltat în cursul evoluției o serie de endonucleaze de restricție care fragmentează materialul genetic intern.

În natură, aceste enzime au evoluat - probabil - ca un sistem de protecție bacteriană împotriva invaziei de molecule străine de ADN, precum cele provenite din fagi.

Pentru a discrimina materialul genetic autohton și străin, aceste endonucleaze de restricție pot recunoaște secvențe de nucleotide specifice. Astfel, ADN care nu are această secvență poate fi nedisturbat în interiorul bacteriilor.

În schimb, când endonucleaza recunoaște locul de restricție, se leagă de ADN și îl taie.

Biologii sunt interesați să studieze materialul genetic al lucrurilor vii. Cu toate acestea, ADN-ul este format din câteva milioane de perechi de baze în lungime. Aceste molecule sunt extrem de lungi și trebuie analizate în fragmente mici.

Pentru a atinge acest obiectiv, endonucleazele de restricție sunt integrate în diferite protocoale de biologie moleculară. De exemplu, o genă individuală poate fi capturată și replicată pentru analize viitoare. Acest proces se numește „clonarea” unei gene.

Polimorfismul lungimii fragmentului de restricție (RFLP)

Polimorfismele de lungime ale fragmentului de restricție se referă la modelul secvențelor nucleotidice specifice din ADN, care endonucleazele de restricție sunt capabile să recunoască și să le taie.

Datorită specificului enzimelor, fiecare organism se caracterizează printr-un model specific de tăiere în ADN, care generează fragmente de lungimi variabile.

Tipuri de endonucleaze de restricție

Istoric, endonucleazele de restricție au fost clasificate în trei tipuri de enzime, desemnate cu cifre romane. Recent, a fost descris un al patrulea tip de endonuclează.

Tip I

Cea mai importantă caracteristică a endonucleazelor de tip I este că sunt proteine ​​formate din mai multe subunități. Fiecare dintre aceste funcții este un complex proteic unic și au de obicei două subunități numite R, două M și una S.

Porțiunea S este responsabilă pentru recunoașterea locului de restricție în ADN. Subunitatea R, din partea sa, este esențială pentru clivaj și M este responsabilă de catalizarea reacției de metilare.

Există patru subcategorii de enzime de tip I, cunoscute de literele A, B, C și D, care sunt în uz comun. Această clasificare se bazează pe complementarea genetică.

Enzimele de tip I au fost primele endonucleaze de restricție descoperite și purificate. Cu toate acestea, cele mai utile în biologia moleculară sunt tipul II, care vor fi descrise în secțiunea următoare.

Tip II

Endonucleazele de restricție de tip II recunosc secvențe specifice de ADN și clivaj într-o poziție constantă aproape de o secvență care produce 5 'fosfați și 3' hidroxil. În general, necesită ioni de magneziu (Mg ²⁺ ) ca cofactori , dar există unii care au cerințe mult mai specifice.

Structurale, ele pot apărea sub formă de monomeri, dimeri sau chiar tetrameri. Tehnologia recombinantă folosește endonucleazele de tip II și din acest motiv au fost caracterizate peste 3.500 de enzime.

Tip III

Aceste sisteme enzimatice sunt compuse din două gene, numite mod și res, care codifică pentru subunitățile care recunosc ADN-ul și pentru modificări sau restricții. Ambele subunități sunt necesare pentru restricție, un proces total dependent de hidroliza ATP.

Pentru a cliva molecula de ADN, enzima trebuie să interacționeze cu două copii ale secvenței de recunoaștere non-palindromă, iar siturile trebuie să fie într-o orientare inversă asupra substratului. Clivajul este precedat de o translocare ADN.

Tip IV

În ultimul timp a fost identificat un grup suplimentar. Sistemul este compus din două sau mai multe gene care codifică proteinele care clivează doar secvențe de ADN modificate, fie metilate, hidroximetilate, fie glucozil hidrometilat.

De exemplu, enzima EckKMcrBC recunoaște două dinucleotide de forma generală RmC; o purină urmată de o citozină metilată, care poate fi separată de mai multe perechi de baze - de la 40 la aproape 3000. Clivajul are loc aproximativ 30 de perechi de baze după locul pe care enzima îl recunoaște.

Endonucleaze tip V

Endonucleazele de acest tip sunt cunoscute și sub denumirea de endonucleaze "homing". Aceste enzime recunosc și taie secvența ADN țintă pe site-urile unice ale genomului de la 14 la 40 pb.

Aceste enzime sunt adesea codificate în introni și funcția lor este de a promova transferul orizontal al secvențelor tăiate. După tăiere, are loc o reparație de rupere în dubla helixă ADN pe baza secvenței complementare.

Exemple

Endonuclează I din E. coli acționează ca un sistem de apărare împotriva fagilor și paraziților. Este localizat în principal între membrana citoplasmatică și peretele celular. Produce pauze dublu catenare în ADN-ul străin cu care interacționează în spațiul periplasmic.

Endonucleazele CRISPR-Cas sunt enzime care acționează asupra mecanismului de apărare al multor tipuri de bacterii. Acestea identifică și taie secvențe specifice de ADN de la organisme invadatoare, care sunt în general viruși.

Recent, cercetătorii de la Massachusetts Institute of Technology (MIT) au descoperit sistemul de editare a genomului CRISPR-Cas12bm cu o precizie ridicată pentru modificarea celulelor umane.

Referințe

1. Burrell, MM (Ed.). (1993). Enzimele biologiei moleculare. Totowa, NJ: Humana Press.
2. Loenen, WA, Dryden, DT, Raleigh, EA, & Wilson, GG (2013). Enzimele de restricție de tip I și rudele lor. Cercetarea acizilor nucleici, 42 (1), 20-44.
3. Murray, PR, Rosenthal, KS, & Pfaller, MA (2017). Microbiologie medicală + StudentConsultă în spaniolă + StudentConsult. Științele sănătății Elsevier
4. Nathans, D., & Smith, HO (1975). Endonucleazele de restricție în analiza și restructurarea moleculelor de ADN. Revizuirea anuală a biochimiei, 44 (1), 273-293.
5. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Endonucleaze de restricție de tip II: structură și mecanism. Științele vieții celulare și moleculare, 62 (6), 685.