ADN RECOMBINANT: TEHNICĂ, APLICAȚII ȘI ELEMENTE FUNDAMENTALE - BIOLOGIE - 2025

ADN recombinant (rADN sau ADNr) este o moleculă de acid nucleic artificial creat în laborator, prin integrarea a două segmente ale organizațiilor de interes. Este cunoscut și sub numele de ADN himeric, datorită proprietății sale hibride. Acest tip de ADN nu se găsește în natură.

Metodologia de bază pentru generarea acestuia include: (a) selecția ADN-ului țintă și inserția acestuia într-un alt fragment de ADN (în general o plasmidă bacteriană); (b) introducerea acestei plasmide într-o bacterie, (c) selectarea bacteriilor cu ajutorul antibioticelor și în final (d) expresia genei.

Sursa: pixabay.com

Tehnica profită de un set de enzime care fac posibilă copierea și lipirea unor fragmente de ADN specifice în conformitate cu judecata cercetătorului.

Scopul tehnologiei recombinante este, în cele mai multe cazuri, expresia unei proteine ​​(cunoscută sub numele de proteină recombinantă) dorită de biologul molecular pentru cercetările viitoare sau pentru crearea unei proteine ​​cu valoare comercială și terapeutică - cum ar fi insulina umană, de exemplu.

Bazele tehnicii ADN recombinant și utilizarea acesteia în inginerie genetică

Dogma centrală a biologiei moleculare

Toate ființele organice pe care le cunoaștem au mai multe caracteristici. Una dintre ele este natura materialului genetic și modul în care sunt făcute proteinele - un proces cunoscut sub numele de „dogma” centrală a biologiei moleculare.

Cu excepția unui cuplu de virusuri, toate organismele stochează informații genetice în ADN (acid dezoxiribonucleic), colectate într-un mod foarte compact și organizat în nucleul celulei.

Pentru expresia genelor, molecula ADN este transcrisă în ARN mesager, iar aceasta din urmă este tradusă în limbajul aminoacizilor, blocurile de construcție ale proteinelor.

Ce este un ADN recombinant?

Între anii ’70 -’80, biologii moleculari au început să profite de procesele care apar în mod natural în interiorul celulei și au fost capabili să le extrapoleze în laborator.

În acest fel, o genă de origine animală (un vertebrat, de exemplu) ar putea fi introdusă într-un segment de ADN dintr-o bacterie; sau ADN-ul unei bacterii ar putea fi combinat cu un ADN viral. Astfel, putem defini un ADN recombinant ca o moleculă formată din ADN din două organisme diferite.

Odată creată această moleculă hibridă sau recombinantă, gena de interes este exprimată. Cu expresia cuvântului vrem să ne referim la procesul de traducere a proteinelor.

Enzime și ligaze de restricție: cheia procesului

Un element cheie în dezvoltarea tehnologiei ADN recombinant a fost descoperirea enzimelor de restricție.

Acestea sunt molecule de proteine ​​care prezintă capacitatea de a cliva ADN-ul (nucleazele) în secvențe specifice, servind ca „foarfece moleculare”. Fragmentele generate de aceste enzime se numesc fragmente de restricție.

Enzimele respective pot produce tăieri simetrice în secvența țintă (în ambele lanțuri la aceeași înălțime) sau tăieri asimetrice. Un aspect cheie al acțiunii enzimelor de restricție este acela că, după clivarea lanțurilor, se obține o „margine liberă”, complementară cu cealaltă muchie tăiată de aceeași enzimă.

Unele exemple sunt ECOR 1 și Sma 1. În prezent, mai mult de 200 de tipuri de enzime de restricție sunt cunoscute și disponibile comercial.

Pentru a fi util, o foarfecă trebuie să fie însoțită de lipici. Această acțiune de etanșare a ADN-ului (tratată anterior cu enzime de restricție) este realizată de ligaze.

Tehnica: cum este modificat ADN-ul unui organism artificial în laborator?

Mai jos vom descrie etapele principale pe care le necesită tehnologia ADN recombinantă. Toate sunt realizate de profesioniști într-un laborator de biologie moleculară.

Ce este o „clonă”?

Înainte de a continua cu protocolul experimental, trebuie să remarcăm că în biologia moleculară și biotehnologie termenul „clonă” și verbul „clonă” sunt utilizate pe scară largă. Acest lucru ar putea duce la confuzie.

În acest context, nu ne referim la clonarea unui întreg organism (ca în cazul celebrei Dolly oile, de exemplu), ci la clonarea unei bucăți de ADN, care poate fi o genă. Adică producerea multor copii - identice genetic - ale secvenței.

1. Izolarea și obținerea ADN-ului

Primul pas este să decideți ce secvență doriți să utilizați. Acest lucru depinde în totalitate de cercetător și de obiectivele activității sale. Acest ADN trebuie apoi izolat și purificat. Metodele și procedurile pentru realizarea acestui lucru depind la rândul lor de corp și de țesut.

În general, o bucată de țesut este preluată și supusă unui tratament într-un tampon de liză cu proteina K (o enzimă proteolitică) și apoi ADN-ul este extras. Ulterior, materialul genetic este fragmentat în fragmente mici.

2. Vector de clonare

După etapele pregătitoare, cercetătorul încearcă să introducă segmentul ADN de interes într-un vector de donare. De acum vom numi acest segment de ADN alb alb.

Plasmidele

Unul dintre cei mai folosiți vectori într-o plasmidă de origine bacteriană. O plasmidă este o moleculă de ADN cu catenă dublă, care se găsește în mod natural în bacterii. Sunt străini de cromozomul bacterian - adică sunt extracromozomali și se găsesc în mod natural în aceste procariote.

Elementele de bază ale unui vector sunt: ​​(a) o origine a replicării, care permite sinteza ADN-ului; (b) agent de selecție, care face posibilă identificarea organismelor care poartă plasmida cu ADN-ul țintă, cum ar fi rezistența la un anumit antibiotic; și (c) loc multiclonare, unde se găsesc secvențele care vor fi recunoscute de enzimele de restricție.

Primul ADN recombinant de succes din laborator a fost donat în plasmida pSC101 din bacteria E. coli. Aceasta conține un loc de restricție pentru enzima de restricție EcoRI și o genă pentru rezistența la un antibiotic, pe lângă originea replicării.

Inserarea ADN-ului țintă în plasmidă se realizează folosind instrumentele moleculare ale enzimelor de restricție și ligazelor descrise în secțiunea anterioară.

Tipuri de vector rămase

În plus față de plasmide, ADN-ul poate fi introdus în alt vector, cum ar fi bacteriofagul lambda, cosmidele, YAC-urile (cromozomii artificiali cu drojdie), BAC-urile (cromozomi artificiali bacterieni) și fagemidele.

3. Introducerea ADN-ului recombinant

Odată obținută molecula ADN recombinantă (gena de interes în plasmidă sau în alt vector), aceasta este introdusă într-un organism gazdă sau gazdă, care poate fi o bacterie.

Pentru a introduce ADN-ul străin într-o bacterie, se utilizează o tehnică numită transformare bacteriană, în care organismul este supus unui tratament cu cationi divalenți care îl face susceptibil de a lua ADN.

Metodologic, nu putem garanta că 100% din bacteriile din cultura noastră au preluat eficient molecula noastră ADN recombinantă. Aici intră în joc porțiunea plasmidei care conține rezistență la antibiotice.

Astfel, bacteriile care au preluat plasmida vor fi rezistente la un anumit antibiotic. Pentru a le selecta, va fi suficient să aplicați respectivul antibiotic și să luați supraviețuitorii.

4. „Recoltează” proteina

După selectarea bacteriilor cu ADN-ul nostru recombinant, procedăm la utilizarea utilajelor enzimatice ale gazdei pentru a genera produsul proteic de interes. Pe măsură ce bacteriile se reproduc, plasmida este transmisă urmașilor lor, deci nu se pierde în timpul diviziunii.

Această procedură folosește bacteriile ca un fel de „fabrică” de proteine. Mai târziu vom vedea că a fost o procedură foarte relevantă în dezvoltarea de tratamente medicale eficiente.

Odată ce cultura este gata și bacteriile au produs cantități mari de proteine, celula este lizată sau perturbată. Există o gamă largă de tehnici biochimice care permit purificarea proteinelor în funcție de caracteristicile fizico-chimice ale acestora.

Într-un alt context experimental, s-ar putea să nu ne intereseze generarea proteinei, ci mai degrabă suntem interesați să obținem în sine secvența de ADN. Dacă acesta ar fi cazul, plasmida ar fi folosită pentru a crea mai multe copii ale fragmentului care ne interesează pentru a avea suficient ADN-ul țintă pentru a efectua experimentele relevante.

Aplicații

Tehnologia ADN recombinantă a deschis un număr infinit de posibilități în biologia moleculară, biotehnologie, medicină și alte domenii conexe. Aplicațiile sale cele mai remarcabile sunt următoarele.

Analiza genetică

Prima aplicație este direct legată de laboratoarele de biologie moleculară. Tehnologia ADN recombinantă permite cercetătorilor să înțeleagă funcția normală a genelor, iar proteinele generate pot fi utilizate în cercetări suplimentare.

Industria farmaceutica

Proteinele produse folosind procedura ADN-ului recombinant au aplicații în medicină. Două exemple foarte relevante în domeniu sunt insulina umană și hormonul de creștere, care se aplică la pacienții care nu au această proteină.

Datorită ADN-ului recombinant, aceste proteine ​​pot fi generate fără a fi nevoie să le extragem dintr-o altă ființă umană, ceea ce reprezintă complicații metodologice și riscuri pentru sănătate. Acest lucru a contribuit la îmbunătățirea calității vieții pentru nenumărați pacienți.

Referințe

1. Baca, LEL, & Álvarez, CLC (2015). Biologie 2. Grupo Editorial Patria.
2. Cooper, GM, Hausman, RE, & Hausman, RE (2000). Celula: o abordare moleculară (Vol. 10). Washington, DC: presă ASM.
3. Devlin, TM (2004). Biochimie: manual cu aplicații clinice. Am inversat.
4. Khan, S., Ullah, MW, Siddique, R., Nabi, G., Manan, S., Yousaf, M., & Hou, H. (2016). Rolul tehnologiei ADN recombinant pentru îmbunătățirea vieții. Revista internațională de genomică, 2016, 2405954.
5. Mindán, FP, & Mindan, P. (1996). Anatomie patologică. Elsevier Spania.
6. Tortora, GJ, Funke, BR, & Case, CL (2007). Introducere în microbiologie. Editura Medicală Panamericană.
7. The, MJ (1989). Insulina umană: primul medicament al tehnologiei ADN. American Journal of Health-System Pharmacy, 46 (11_suppl), S9-S11.