COLORAREA NEGATIVĂ: RAȚIUNE, TEHNICĂ, AVANTAJE ȘI DEZAVANTAJE - BIOLOGIE - 2025

Colorația negativă este o metodă de colorare specială pentru a evidenția prezența capsulei în unele microorganisme , în principal , Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae și Cryptococcus neoformans-, din probe clinice sau culturi pure.

Eșantionul direct utilizat frecvent pentru aplicarea colorației negative este lichidul cefalorahidian. Această tehnică reprezintă o alternativă rapidă pentru diagnosticul prezumtiv al meningitei, în special Cryptococcus neoformans.

A. Tartru dentar colorat cu cerneală India, B. Cryptococcus neoformans var gatti slab încapsulat, deoarece apare în natură, folosind nigrosină. C. Cryptococcus neoformans var gatti cu o capsulă groasă, așa cum se găsește în forma sa parazitară, folosind nigrosină. D. Neoformani Cryptococcus cu cerneală ușor diluată India. Gisell Quinde, de la Wikimedia Commons / CDC, prin Wikimedia Commons / Credit foto: Furnizori de conținut: CDC / Dr. Leanor Haley, prin Wikimedia Commons

De asemenea, această pată poate fi aplicată pe spută și lichide sterile în general, precum și pe tulpini obținute din culturi pure tinere. Această tehnică folosește cerneală nigrosină sau India pentru execuția sa; prin urmare, este o metodologie foarte simplă și ieftină de aplicat, care oferă informații de mare valoare diagnostică într-un timp scurt.

În acest sens, orice laborator este capabil să efectueze această colorare. Desigur, laboratorul trebuie să aibă personal competent, capabil să recunoască drojdiile Cryptococcus neoformans izolate sau în devenire și să le diferențieze de leucocite și artefacte pe care le poate prezenta eșantionul.

Bază

Nigrosina și India cerneala funcționează într-un mod similar; prin urmare, oricare dintre cele două substanțe poate fi folosită în mod interschimbabil.

Această tehnică se numește colorare negativă, deoarece acționează într-un mod contrar celorlalte tehnici de colorare. În aceasta, ceea ce rămâne nedeparat este structura căutată sau pe care cineva dorește să o vadă; adică microorganisme.

Prin urmare, colorarea se bazează pe colorarea fundului frotiu de o culoare închisă. În acest scenariu, structurile capsulate vor ieși în evidență în culori deschise sau incolore.

În general, drojdiile sunt refringente, înconjurate de un halou limpede care corespunde capsulei. Acest lucru se întâmplă deoarece cerneala și nigrosina din India sunt substanțe incapabile să pătrundă polizaharida care formează capsula microorganismelor vii.

De remarcat este faptul că alte structuri care pot fi prezente în eșantionul direct, cum ar fi leucocitele sau globulele roșii, nu penetrează niciuna.

Cu toate acestea, dacă microorganismele sunt moarte, colorantul poate pătrunde în interiorul lor, astfel încât această colorare este utilă și pentru a evalua viabilitatea microorganismelor.

Tehnică

materiale

Nigrosine

Nigrosina își datorează numele culorii negre pe care o are. Este o substanță sintetică care se obține prin încălzirea amestecului de compuși organici - cum ar fi nitrobenzină, anilină și clorhidrat de anilină -, folosind un catalizator (fier sau cupru) în respectiva reacție.

Cerneală chinezească

Cerneala chineză este o substanță folosită mai ales de asiatici pentru scriere, realizarea de opere de artă și pictura monocromatică. Este foarte popular în cultura chineză.

Este obținut din cerneală de calamar amestecat cu cărbune pulverizat, produsul arderii copacilor cu rășinoase scăzute.

De asemenea, este posibil să o prepari din funingine din incinerarea hidrocarburilor (uleiuri vegetale), împreună cu o gelatină proteică care îi conferă consistența potrivită pentru a evita precipitarea particulelor de carbon.

Specificații pentru eșantionare

- Nu necesită post.

- Eșantionul CSF, spută sau lichid steril trebuie să conțină cel puțin 1 ml de volum și trebuie transferat imediat la laborator la temperatura camerei.

- Probele de LCR și lichide sterile trebuie prelevate de un medic specializat.

- Poate fi, de asemenea, o cultură pură a unei tulpini suspecte legate de agenții patogeni menționați mai sus.

Executarea tehnicii cu probe directe

- Probele trebuie centrifugate, apoi supernatantul este aruncat și se ia sedimentul.

- O picătură din materialul centrifugat (sedimente) și o picătură de cerneală sau nigrosină din India sunt așezate pe o lamelă curată.

- Trebuie amestecat bine și acoperit cu o foaie de acoperire, permițând picăturii să se răspândească sub formă de peliculă subțire, fără a trece peste margini.

- Ulterior, preparatul este montat la microscop.

- Dacă preparatul este prea întunecat, acesta poate fi diluat cu apă.

Executarea tehnicii cu tulpini din cultură

- O porțiune foarte mică dintr-o cultură tânără este preluată cu un ac de însămânțare și dizolvată într-o picătură de cerneală India așezată anterior pe o lamelă curată.

- Deasupra se așază o copertină.

- Se observă la microscop la 10X și apoi la 40X.

De asemenea, puteți dizolva o porție din colonie în apă distilată și de acolo luați o picătură și amestecați-o cu cerneala India. În acest fel, preparatul nu va fi atât de gros, făcând posibilă observarea structurilor izolate; dacă există mulțimi, nu va fi bine observat.

O altă metodologie este următoarea:

- Plasați o picătură a culturii de suspensie pe un capăt al diapozitivului.

- Puneți o picătură de nigrosină în același capăt și amestecați.

- Cu ajutorul unui alt diapozitiv, răspândiți eșantionul ca și cum ar face un frotiu hematologic.

- Lăsați să se usuce și observați la microscop.

Observarea microscopului

Mai întâi trebuie să vă concentrați cu un obiectiv 10X pentru a avea o vedere largă a câmpului. Ulterior, trebuie căutat dacă există spații clare; dacă există, concentrați-vă 40X pentru a vedea detaliile.

Avantaj

- Este ușor de executat.

- Este o tehnică ieftină.

- Această metodă nu necesită ca frotiul să fie fixat la căldură sau cu substanțe chimice; prin urmare, microorganismele sunt observate fără distorsiuni.

- Preparatul proaspăt nu trebuie să fie uscat, deci poate fi observat imediat, generând rezultate rapid.

Dezavantaj

Odată asamblate, trebuie observate imediat preparate proaspete; dacă li se permite să se usuce nu mai este posibil să le observe și trebuie instalat unul nou.

Colorarea țesuturilor cu cerneală din India

O altă funcție pe care o poate îndeplini cerneala India este în laboratoarele de patologie. Aceasta se aplică probelor de țesut extras chirurgical pentru a marca marjele de rezecție ale tumorii.

Țesutul marcat este pulverizat cu acid acetic. Aceasta acționează ca un mordant și împiedică scurgerea de cerneală atunci când țesutul este supus unei prelucrări de rutină pentru prepararea biopsiei.

Procedura constă în scăldarea țesutului în alcool și xilen, apoi înmuierea acestuia în ceară de parafină. Acest marcaj îl ghidează pe patolog atunci când observă țesutul, indicând unde este marja de rezecție chirurgicală sau alt punct de interes.

Referințe

1. «Nigrosina». Wikipedia, enciclopedia gratuită. 11 iul 2017, 22:46 UTC. 6 ianuarie 2019, 16:56: en.wikipedia.org
2. „Cerneală chinezească”. Wikipedia, enciclopedia gratuită. 1 Oct 2018, 03:08 UTC. 6 ian 2019, 18:20: es.wikipedia.org/
3. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J și colaboratori. (2006). Personalul muncii al comunității autonome din Extremadura. Agenda specifică Volumul IV. Editorial MAD. Sevilla-Spania, pp. 211-212.
4. Silva M, García M, Corrales J, Ponce E. (2006). Tehnician specializat de laborator, Serviciul de Sănătate Galician (SERGAS). Volumul specific al agendei de subiect 2. Editorial MAD. Sevilla-Spania, pp. 79-80.
5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Diagnostic microbiologic Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana SA