PATA GRAM: RAȚIUNE, MATERIALE, TEHNICĂ ȘI UTILIZĂRI - BIOLOGIE - 2025

Gram pata este cea mai simplă și cea mai utilă de colorare tehnica in microbiologie de diagnostic. Această tehnică a fost creată de medicul danez Hans Christian Gram în 1884, care a reușit să clasifice bacteriile drept Gram pozitive și Gram negative, conform compoziției peretelui celular.

Tehnica a suferit anumite modificări de către Hucker în 1921 pentru a stabiliza reactivii și a îmbunătăți calitatea colorației, motiv pentru care colorația Gram este cunoscută și sub numele de Gram-Hucker.

Diverse frotiuri colorate cu colorație Gram. A. Cocci gram pozitivi. B. tije Gram negative. C. Bacili gram pozitivi, polimorfonucleari și mononucleari. D. Drojdii.

Cu această tehnică este posibilă și observarea formei microorganismelor, adică dacă sunt cocci, bacili, coccobacili, pleomorfe, filamentoase, printre altele. La fel ca și distribuția lor în spațiu: într-un cluster, într-un lanț, izolat, în perechi, în tetraduri etc.

În cazul în care se suspectează o infecție bacteriană, majoritatea probelor primite trebuie tratate pe o lamelă și colorate cu Gram pentru examen microscopic.

Raportul Gram îl va ghida pe medic cu privire la ce tip de microorganism poate fi cauza infecției, înainte de a obține rezultatul final al culturii.

În unele cazuri, viața pacientului este foarte compromisă, de aceea medicii au nevoie urgentă de raportul Gram pentru a pune un tratament empiric, în timp ce așteaptă identificarea microorganismului.

De exemplu, dacă Gram arată că în lichidul cefalorahidian există cocci Gram pozitivi, medicul va ghida terapia inițială cu antibiotice care elimină acest tip de bacterii, conform protocoalelor stabilite pentru aceasta.

Odată ce rezultatul final ajunge cu numele microorganismului izolat și al antibiogramei respective, medicul va evalua dacă va modifica sau nu terapia. Această decizie va fi luată conform studiului susceptibilității microorganismului la antibiotice pe care le primește și a evoluției pacientului.

Bază

Aceasta este o tehnică care are 4 pași fundamentali: colorarea, fixarea cu mordantul, decolorarea și contracararea. Prin urmare, această tehnică, pe lângă colorarea bacteriilor, permite și diferențierea lor.

Violetul de cristal este primul colorant folosit. Are o afinitate pentru peptidoglican și va colora toate bacteriile prezente purpurii, ulterior este plasat lugolul, care acționează ca un mordant, adică va induce formarea complexelor de cristal violet-iod insolubile - proteine ​​ribonucleare în interiorul celulei. .

Bacteriile gram pozitive, având un perete gros de peptidoglican, formează mai multe complexe (cristal violet-iod), prin urmare ele păstrează colorantul.

În plus, influențează și faptul că peretele bacteriilor Gram pozitive conține o cantitate mai mare de acizi nesaturați, care arată o afinitate mare pentru agenții de oxidare (Lugol).

Între timp, bacteriile Gram negative au un strat subțire de peptidoglican, ceea ce face ca bacteriile să formeze mai puține complexe decât cele Gram pozitive.

Apoi vine etapa de decolorare, unde bacteriile Gram pozitive și Gram negative se comportă diferit.

Bacteriile gram negative conțin o membrană externă bogată în lipopolizaharide care face parte din peretele lor celular. Grăsimile sunt distruse prin contactul cu alcoolul acetonic, astfel încât membrana exterioară devine destabilizată, eliberând cristalul violet.

Așa se combate cu safranina sau fuchsinul de bază, devenind roșu.

În cazul bacteriilor Gram pozitive, acestea rezistă la decolorare, deoarece înălbitorul funcționează prin închiderea porilor, împiedicând scurgerea complexului violet / iod de cristal.

Prin urmare, colorația cu cristal violet rămâne stabilă și nu există loc pentru safranină sau fuchsină. Acesta este motivul pentru care aceste bacterii colora albastru profund sau violet.

materiale

Setul de colorare Gram este format din:

• Pahar violet
• Lugol
• Alcool acetonic
• Safranin sau fuchsin de bază

Prepararea coloranților și a reactivilor

Soluție violet de cristal

Solutie la:

Cristal violet ------------- 2 gr

Alcool etilic 95% ----------- 20cc

Soluția B:

Oxalat de amoniu ----------- 0,8 gr

Apa distilată ------------- 80 cmc

Pentru prepararea finală a cristalului violet, soluția A trebuie diluată 1:10 cu apă distilată și amestecată cu 4 părți ale soluției B. Amestecul se păstrează 24 de ore înainte de utilizare. Se filtrează într-o sticlă de colorare de chihlimbar cu hârtie de filtru.

Cantitatea de utilizat zilnic este transferată într-o sticlă cu picătură de chihlimbar.

Lod-Lugol

Se cântărește și se măsoară cantitatea indicată a fiecărui compus, după cum urmează:

Cristale de iod ------------- 1gr

Iodură de potasiu ------------- 2gr

Apa distilată ------------- 300 cmc

Iodura de potasiu se dizolvă puțin în apă și apoi se adaugă iodul. Soluția este bărbierită într-o sticlă de chihlimbar.

Cantitatea de utilizat zilnic este transferată într-o sticlă de chihlimbar mai mică, cu un picurator.

Albire

95% alcool etilic -----------– 50 ml

Acetonă ------------------ 50 ml

Se prepară în părți egale. Acoperiți bine, deoarece are tendința de a se evapora.

Se introduce într-o sticlă cu picătură.

Acest preparat oferă o decolorare în timp moderat 5-10 secunde și este cel mai recomandat.

Începătorii preferă să folosească doar 95% alcool etilic, unde decolorarea este mai lentă de 10 până la 30 sec.

În timp ce cei mai experimentați pot utiliza acetona pură, unde decolorarea apare foarte repede de la 1 la 5 sec.

Contrast

Soluția stocurilor de safranin

Safranina -------------– 2,5 gr

Alcool etilic 95% --------– 100 cc

După cântărirea cantității indicate de safranină, se dizolvă în 100 ml alcool etilic 95%.

Soluția de safranină de lucru este preparată din soluția de stoc.

Pentru a face acest lucru, măsurați 10 cc de soluție stoc, adăugați 90 cmc de apă distilată pentru a face 100 ml.

Este recomandat să transferați cantitatea care va fi utilizată zilnic într-o sticlă de chihlimbar cu un picurator.

Microorganismele care colora slab Gram negativ cu pata Gram-Hucker, cum ar fi anumite anaerobe, Legionella sp, Campylobacter sp și Brucella sp, pot fi colorate mult mai bine folosind modificarea de către Kopeloff a petei Gram-Hucker, numită pata Gram-Kopeloff.

Această tehnică schimbă colorantul de safranină în fuchsin de bază. Cu această modificare este posibil să se coloreze eficient microorganismele menționate anterior.

Depozitarea reactivilor

Coloranții pregătiți trebuie păstrați la temperatura camerei.

Prepararea frotiei probei de colorat

O probă trebuie să conțină cel puțin 10 ⁵ microorganisme înainte de observarea microorganismului într-un frotiu. Frotiurile pot fi făcute din eșantion direct sau din culturi în mediu solid sau lichid.

Frotiurile trebuie să fie uniforme, bine distribuite și nu prea groase, pentru o mai bună vizualizare a structurilor prezente.

-Gram de probe directe

Gram de urină necentrifugată

Urina este amestecată și 10 ui se așază pe o lamelă. Observarea a cel puțin unei bacterii / câmp Dip este indică faptul că există o infecție.

Aceasta înseamnă că cultura va avea aproximativ peste 100.000 CFU / ml (10 ⁵ CFU / ml) de urină în 85% din cazuri.

Această metodă nu este utilă pentru numărul de colonii sub 100.000 CFU.

CSF Gram

CSF trebuie centrifugat, supranatantul îndepărtat și peletul se întinde pe o lamelă. Acest lichid este steril în condiții normale; observarea bacteriilor indică infecție.

Gram de probe respiratorii

Sputa, bronhial sau bronhoalveolar lavaj Gram, deși poate exista o varietate de microorganisme, va ghida întotdeauna diagnosticul, pe lângă faptul că este util tipul de celule observate.

În cazul sputei, frotiul trebuie preparat cu cele mai purulente porțiuni din probă.

Gram de scaun

Nu este recomandat să efectuați un Gram pe acest tip de probe, deoarece nu are nicio valoare de diagnostic.

-Grama de culturi

Ele pot fi realizate în două moduri, unul din culturi lichide și celălalt din culturi solide.

Culturi lichide

Din culturile lichide este extrem de simplu; Mai multe fripturi de bulion tulbure sunt luate sub arzător și așezate pe un tobogan curat și uscat, făcând mișcări circulare din centru spre periferie, pentru a distribui materialul în mod uniform.

Lăsați-l să se usuce spontan în aer. Odată uscat, materialul este fixat pe foaie cu căldură. Pentru a face acest lucru, cu ajutorul unei pensete, foaia este trecută de 3 până la 4 ori prin flacăra arzătorului Bunsen, având grijă să nu arzi materialul.

Foaia este lăsată să se răcească și este așezată pe puntea de colorare.

Culturi solide

Pentru a efectua un frotiu pentru colorația Gram dintr-o cultură solidă, procedați după cum urmează:

Înainte de a alege coloniile care urmează să fie luate, toboganul trebuie pregătit, punând aproximativ două picături de soluție salină fiziologică sterilă.

Dacă placa de cultură originală conține mai multe tipuri diferite de colonii, o colonie izolată a fiecăreia va fi aleasă pentru a efectua gramul. Fiecare colonie va fi luată cu bucla de platină pentru a se dizolva în soluția salină plasată anterior pe lamelă.

Mișcările circulare se fac din centru spre periferie, pentru a distribui omogen colonia pe diapozitiv.

Lăsați-l să se usuce spontan în aer. Odată uscat, fixați foaia cu căldură, așa cum s-a explicat anterior (flăcând lamela cu bricheta), având grijă să nu ardeți materialul.

Această procedură trebuie făcută cu fiecare tip diferit de colonie. Pe o bucată de hârtie, trebuie notată ordinea celor observate, de exemplu:

Colonia 1: Colonia betahemolitică galbenă: Cocoșii gram pozitivi au fost observați în grupuri

Colonia 2: Colonia de culoare cremă, fără hemoliză: s-au observat coccobacili gram negativi.

Fiecare diapozitiv trebuie etichetat pentru a ști ce observăm.

Tehnică

Tehnica de colorare Gram este extrem de ușor de efectuat și relativ ieftină și nu poate fi ratată într-un laborator de microbiologie.

Se face după cum urmează:

1. Fixați frotiul cu căldură și așezați-l pe podul de colorare.
2. Acoperiți lamela complet cu violet de cristal timp de 1 minut.
3. Spălați-vă cu apă Nu uscați
4. Acoperiți foaia cu soluție de lugol, lăsați să acționeze 1 minut. Spălați-vă cu apă Nu uscați.
5. Înălbitor timp de 5-10 secunde cu agitare blândă în alcool acetonă. Sau așezați foaia într-o poziție verticală și aruncați picături ale decolorului pe suprafață până când se elimină excesul de sticlă violetă neretinută. Nu depășiți.
6. Spălați-vă cu apă Nu uscați.
7. Înlocuiți diapozitivul pe podul de colorare și acoperiți timp de 30 de secunde cu safranină (Gram-Hucker) sau 1 min cu fuchsin de bază (Gram-Kopeloff).
8. Spălați-vă cu apă
9. Lăsați-l să se usuce spontan într-o poziție verticală.

Odată uscat, așezați 1 picătură de ulei de imersiune pentru a-l observa sub obiectivul 100X la microscopul ușor.

Utilitate

Această tehnică permite să distingă diferențele morfotintoriale ale majorității bacteriilor.

Drojdiile se disting și prin această colorare. Ei iau violetul de cristal, adică pătează Gram pozitiv.

Pe de altă parte, se pot distinge tije Gram-pozitive formatoare de spori, în care se observă un spațiu limpede în interiorul bacilului, unde s-a format endosporul, deși sporii nu se colorează bine. Alte tehnici, cum ar fi Shaeffer-Fulton, sunt folosite pentru colorarea sporilor.

Trebuie menționat că această colorare nu este folosită pentru a colora toate tipurile de bacterii, adică există cazuri în care colorarea nu funcționează.

În acest caz, bacteriile care nu au perete celular pot fi menționate. De exemplu: genul Mycoplasma, sferoplastele, ureaplasma, formele L și protoplastele.

De asemenea, pătează foarte slab bacteriile cu pereți bogați în acizi micolici, cum ar fi Mycobacteria, și bacterii intracelulare, cum ar fi Chlamydias și Rickettsia.

De asemenea, este ineficient în colorarea majorității bacteriilor spirochetale.

Există bacterii din același gen care pot fi observate în același eșantion ca Gram pozitiv și Gram negativ. Când se întâmplă acest lucru, se numește pata Gram variabilă, care se poate datora modificării nutrienților, temperaturii, pH-ului sau concentrației de electroliți.

Greșeli comune

Albire exagerată

Exagerarea în etapa de decolorare poate duce la observarea unor microorganisme Gram negative negative.

Nu așteptați suficient timp de uscare pentru a adăuga uleiul de imersiune

Poate determina bacteriile Gram pozitive să coloreze Gram negative (false Gram negative). Acest lucru se întâmplă deoarece în culturile vechi există probabilitatea de a fi bacterii moarte sau deteriorate și în aceste condiții, bacteriile nu păstrează cristalul violet.

Folosiți soluție lugol foarte veche:

De-a lungul timpului lugolul își pierde proprietățile și culoarea sa se estompează. Dacă se folosește reactivul deja degenerat, acesta nu va repara bine cristalul violet, de aceea există posibilitatea obținerii unei vizualizări a microorganismelor fals negative.

Fundal albastru

Un fundal decolorat corespunzător va fi roșu. Un fundal albastru indică faptul că decolorarea a fost insuficientă.

Referințe

1. Ryan KJ, Ray C. 2010. Sherris. Medical Microbiology, a 6-a ediție McGraw-Hill, New York, SUA
2. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosticul microbiologic. (Ediția a 5-a). Argentina, Editorial Panamericana SA
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Diagnostic microbiologic Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana SA
4. Casas-Rincón G. 1994. Micologie generală. Ediția a 2-a Universitatea Centrală din Venezuela, Ediții bibliotecare. Venezuela Caracas.
5. "Pata de Gram". Wikipedia, enciclopedia gratuită. 4 octombrie 2018, ora 23:40 UTC. 9 Dec 2018, ora 17:11. Luat de pe es.wikipedia.org.
6. González M, González N. 2011. Manual de Microbiologie medicală. Ediția a II-a, Venezuela: Direcția de media și publicații a Universității Carabobo.
7. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Petele de bază în laboratorul de microbiologie. Cercetări în domeniul dizabilității. 2014; 3 (1): 10-18.