PATA GIEMSA: RAȚIUNI, MATERIALE, TEHNICĂ ȘI UTILIZĂRI - BIOLOGIE - 2025

Giemsa pata este un tip de colorare probe clinice, pe baza amestecului de coloranți acizi și bază. Crearea sa a fost inspirată de lucrările realizate de Romanowsky, unde Gustav Giemsa, chimist și bacteriolog originar din Germania, a perfecționat-o prin adăugarea de glicerol pentru a stabiliza compușii.

Modificările generate de tehnica originală Romanowsky au permis îmbunătățirea considerabilă a observațiilor microscopice, de aceea tehnica a fost botezată cu numele de pată Giemsa.

Diverse probe colorate cu pata Giemsa. A. Trypanosoma evansi în sângele periferic. B. Celule normale din sânge. C. Borrelia theileri în sângele periferic. Limfomul lui Burkitt.

Deoarece este o tehnică simplă de efectuat, extrem de funcțională și economică, este utilizată în prezent pe scară largă în laboratorul clinic pentru frotiuri hematologice, probe de măduvă osoasă și secțiuni de țesut.

Tehnica de colorare a Giemsa este foarte utilă pentru studii citologice, deoarece permite observarea structurilor celulare specifice. Această tehnică colorează citoplasmele, nucleele, nucleolii, vacuolele și granulele de celule, putând distinge chiar urme fine de cromatină.

Mai mult, pot fi detectate modificări semnificative ale mărimii, formei sau colorației nucleului, unde este posibilă vizualizarea pierderii relației nucleo-citoplasmă.

Pe de altă parte, permite identificarea celulelor imature din măduva osoasă și sângele periferic, fiind importantă pentru diagnosticul de boli grave precum leucemia. De asemenea, este posibil să se detecteze hemoparaziți, bacterii suplimentare și intracelulare, ciuperci, printre altele.

În citogenetică este utilizat pe scară largă, deoarece este posibilă studierea mitozei celulelor.

Bazele colorației Giemsa

Coloranții de tip Romanowsky se bazează pe utilizarea unui contrast între coloranții acizi și bazici, pentru a realiza colorarea structurilor de bază și respectiv a acidului. După cum se poate observa, există o afinitate a coloranților acizi de a colora structurile de bază și invers.

Colorantul de bază utilizat este albastrul de metilen și derivații săi oxidați (Azure A și Azure B), în timp ce colorantul acid este eozina.

Structurile acide ale celulelor sunt acizii nucleici, granulele bazofilelor segmentate, printre altele, de aceea vor fi colorate cu albastru de metilen.

În același sens, structurile de bază ale celulelor sunt hemoglobina și unele granule precum cele conținute în eozinofile segmentate, printre altele; acestea vor fi colorate cu eozină.

Pe de altă parte, datorită faptului că albastrul de metilen și azurul se caracterizează prin a fi coloranți metachromatici, aceștia pot oferi o nuanță variabilă diferitelor structuri în funcție de încărcarea polianionilor pe care le dețin.

Așa se face că combinația strategică de coloranți de bază și acizi reușește să dezvolte un spectru larg de culori, în funcție de caracteristicile biochimice ale fiecărei structuri, mergând prin nuanțe palide, albastru închis, lila și violet în cazul structurilor acide.

În timp ce colorația oferită de eozină este mai stabilă, generează culori între roșiatic-portocaliu și somon.

materiale

Materiale pentru pregătirea soluției stoc

Prepararea soluției stoc necesită o greutate de 600 mg de colorată de Giemsa pudră, măsurând 500 cmc de alcool metilic fără acetonă și 50 cm de glicerină neutră.

Cum se prepară soluția de stoc

Puneți praful Giemsa grele într-un mortar. Dacă există bulgări, acestea trebuie pulverizate. Ulterior se adaugă o cantitate apreciabilă de glicerină măsurată și se amestecă foarte bine. Amestecul obținut se toarnă într-o sticlă de chihlimbar foarte curată.

Restul glicerinei este plasat în mortar. Se amestecă din nou pentru a curăța restul de colorant care s-a lipit de pereții mortarului și se toarnă în același borcan.

Sticla este acoperită și introdusă într-o baie de apă la 55 ° C timp de 2 ore. În timp ce se află într-o baie de apă, agitați ușor amestecul la fiecare jumătate de oră sau cam așa ceva.

Ulterior, amestecul este lăsat să se răcească pentru a pune alcoolul. Anterior, o parte din alcoolul măsurat este plasat în mortar pentru a termina spălarea colorantului rămas, apoi este adăugat la amestec împreună cu restul de alcool.

Acest preparat trebuie lăsat să se maturizeze cel puțin 2 săptămâni. Porțiunea utilizată a soluției stoc trebuie filtrată.

Pentru a evita contaminarea preparatului, se recomandă să transferați porțiunea care va fi în uz constant la o sticlă mică de chihlimbar cu un picurator. Reumpleți de fiecare dată când reactivul se termină.

Materiale pentru prepararea soluției tampon

Pe de altă parte, o soluție tampon la pH 7,2 este preparată după cum urmează:

6,77 g de fosfat de sodiu (anhidru) (NaHPO ₄ ), 2,59 g de fosfat diacid de potasiu (KH ₂ PO ₄ ) și apă distilată se cântăresc până la 1000 cc.

Prepararea finală a colorantului

Pentru prepararea soluției de colorare finală, se măsoară 2 ml soluție stoc filtrată și se amestecă cu 6 ml soluție tampon. Amestecați amestecul.

Un fapt relevant care trebuie luat în considerare este faptul că tehnicile de preparare a coloratului se pot schimba în funcție de compania comercială.

Materiale suplimentare necesare pentru realizarea colorației

În afară de materialele descrise, trebuie să aveți punți de colorat, tricouri cu apă sau tampon pentru spălare, diapozitive de obiecte sau huse pentru obiecte, un cronometru care să controleze timpii de colorat și să blocheze hârtie sau ceva material care poate fi folosit pentru uscare ( tifon sau bumbac).

Tehnică

Proces de colorare

1) Înainte de colorare, frotiul probei trebuie să fie gata pe o lamelă curată.

Probele pot fi sânge, măduvă osoasă, secțiuni histologice de țesut sau probe cervico-vaginale. Se recomandă ca spreadurile să fie subțiri și să aibă 1 sau 2 ore de uscare înainte de colorare.

2) Pe un pod colorat, așezați toate foile care trebuie colorate. Lucrezi întotdeauna în aceeași ordine și fiecare foaie este bine identificată.

3) Puneți câteva picături de alcool metilic 100% (metanol) pe frotiu și lăsați-l să acționeze 3 - 5 minute, pentru a fixa și deshidrata proba.

4) Aruncați metanolul prezent pe foaie și lăsați să se usuce.

5) Odată uscat, așezați soluția finală de colorare cu un picurator până când întreaga foaie este acoperită. Se lasă să acționeze 15 minute. Unii autori recomandă până la 25 de minute. Depinde de casa de afaceri.

6) Goliți pata și spălați frotiul cu apă distilată sau cu o soluție tampon de 7,2.

7) Pe o hârtie blotting, lăsați foile să se usuce în aer liber, aranjate vertical cu ajutorul unui suport.

8) Curățați spatele toboganului cu un tampon de alcool sau un tampon de bumbac pentru a îndepărta urmele de pată.

Utilități

Tehnica de colorare Giemsa este folosită în diferite domenii, inclusiv: hematologie, micologie, bacteriologie, parazitologie, citologie și citogenetică.

Hematologie

Este cea mai frecventă utilizare dată acestei pete. Cu ajutorul acesteia, fiecare dintre celulele prezente în măduva osoasă sau probele de sânge periferice pot fi identificate. De asemenea, estimează numărul fiecărei serii, fiind capabil să detecteze leucocitoză sau leucopenie, trombocitopenie etc.

Deoarece este sensibil în identificarea celulelor imature, este relevant în diagnosticul de leucemii acute sau cronice. De asemenea, este posibil să se facă diagnosticul de anemie, cum ar fi anemia cu celule secera, celula de secera, printre altele.

Micologie

În această zonă, utilizarea sa este obișnuită pentru a căuta Histoplasma capsulatum (ciuperca dimorfă intracelulară) în probele de țesut.

Bacteriologie

În frotii hematologice colorate cu Giemsa este posibil să se detecteze Borrelias sp la pacienții care prezintă boala numită febră recurentă. Spirochetele sunt abundente în rândul eritrocitelor, în probele prelevate la vârful febrei.

De asemenea, este posibilă vizualizarea bacteriilor intracelulare precum Rickettsia sp și Chlamydia trachomatis în celulele infectate.

parazitologie

În domeniul parazitologiei, colorația Giemsa a făcut posibilă diagnosticarea bolilor parazite precum malaria, boala Chagas și leishmaniaza.

În primii doi paraziții Plasmodium sp și Trypanosoma cruzi pot fi observați în sângele periferic al pacienților infectați, aceștia pot fi găsiți în diferite etape, în funcție de faza în care se află boala.

Pentru a îmbunătăți căutarea paraziților în sânge, se recomandă utilizarea petei Giemsa amestecată cu pata May-Grünwald.

De asemenea, leishmanioza cutanată poate fi diagnosticată prin evaluarea probelor de biopsie a pielii colorate cu Giemsa unde se găsește parazitul.

Citologie

Colorația Giemsa este de asemenea folosită pentru studiul citologic al probelor endocervicale, deși nu este cea mai frecvent utilizată tehnică în acest scop.

Dar, în cazuri de lipsă de resurse, acesta poate fi utilizat, având o funcționalitate similară cu cea oferită de tehnica Papanicolaou și cu un cost mai mic. Cu toate acestea, necesită expertiză din partea examinatorului.

Citogenetică

O caracteristică relevantă a colorației Giemsa este capacitatea sa de a se lega puternic de regiunile ADN și bogate în timină de ADN. Acest lucru permite vizualizarea ADN-ului în timpul mitozei celulare, în diferite stări de condensare.

Aceste studii sunt necesare pentru a detecta aberații cromatice, cum ar fi duplicări, ștergeri sau translocări ale diferitelor regiuni ale cromozomilor.

Cercetări care demonstrează eficacitatea petei de Giemsa

Cannova et al (2016), au comparat 3 tehnici de colorare pentru diagnosticul de leishmanioză cutanată.

Pentru aceasta, au utilizat probe obținute de la un animal experimental (Mesocrisetus auratus) inoculat experimental cu Leishmanias.

Autorii au demonstrat că pata de Giemsa a fost mai bună decât patul Pap-mart® și Gaffney. Prin urmare, au considerat că pata de Giemsa este ideală pentru diagnosticul de leishmanioză cutanată.

Rezultatele excelente obținute de autori se datorează faptului că combinația de coloranți care alcătuiesc amestecul Giemsa prezintă condițiile necesare pentru a crea un contrast favorabil, permițând clar distingerea structurilor amastigotelor, atât intracelular cât și extracelular.

Celelalte tehnici (Pap-mart® și Gaffney) au făcut-o și ele, dar într-un mod mai slab și, prin urmare, mai dificil de vizualizat. De aceea, pata de Giemsa este recomandată pentru diagnosticul parazitologic al leishmaniozei.

De asemenea, un studiu realizat de Ramírez și colab. (1994) a evaluat validitatea petelor de Giemsa și Lendrum în frotiuri conjunctivale pentru identificarea Chlamydia trachomatis.

Autorii au stabilit că petele de Giemsa și Ledrum au o specificitate egală, dar s-a constatat că Giemsa este mai sensibilă.

Acest lucru explică de ce pata de Giemsa este în prezent cea mai frecvent utilizată pentru diagnosticul infecțiilor cu clamidiale, mai ales dacă există puține resurse.

Sursa: Reactivi ITR PanReac Applichem. Pata de Giemsa. Versiunea 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Spania.

Recomandări pentru o colorare bună

Uscarea foilor nu trebuie accelerată. Trebuie să se aștepte o perioadă rezonabilă de timp pentru a o usca în aer liber. Aproximativ 2 ore.

Colorați imediat după 2 ore pentru a obține cele mai bune rezultate.

Pentru ca frotiurile să se fixeze și să coloreze mai bine, eșantionul trebuie distribuit pe diapozitiv astfel încât să rămână un strat subțire și uniform.

Proba de sânge preferată este capilară, deoarece frotiul este făcut direct din picătura de sânge și, prin urmare, proba nu conține aditivi, ceea ce favorizează menținerea structurilor celulare.

Cu toate acestea, dacă se utilizează sânge venos, EDTA trebuie utilizat ca anticoagulant și nu heparină, deoarece de obicei heparina deformează celulele.

Greșeli frecvente în colorarea Giemsa

În practica acestei colorații se pot face greșeli. Ele sunt evidențiate de schimbări bruște ale tonalităților structurilor.

Colorant extrem de albastru

Se poate datora:

• Frotiuri foarte groase
• Depășirea timpului de colorare
• Spălați-vă insuficient.
• Utilizarea reactivilor cu mult peste un pH neutru (alcalin)

În aceste condiții, culorile următoarelor structuri sunt distorsionate, în așa fel încât eritrocitele în loc să coloreze roz-somon vor apărea verzi, granulele eozinofilelor care trebuie să fie pătate de cărămidă roșie vor deveni albăstrui sau gri și așa mai departe vor exista abatere în tonurile obișnuite.

Colorant excesiv roz

Se poate datora:

• Timp insuficient de colorare.
• Spălare prelungită sau excesivă.
• Uscare necorespunzătoare
• Utilizarea de reactivi foarte acide.

În acest caz particular, structurile care păstrează în mod normal albastrul nu vor fi aproape vizibile, în timp ce structurile care colora roz vor avea nuanțe exagerate.

Exemplu: globulele roșii vor deveni roșu aprins sau portocaliu strălucitor, cromatina nucleară va apărea roz pal, iar granulele de eozinofil vor păta roșu intens.

Prezența precipitațiilor în frotiu

Cauzele pot fi:

• Folosiți filme murdare sau slab spălate.
• Nu lăsați frotiul să se usuce bine.
• Lăsând soluția de fixare prea mult timp.
• Spălare inadecvată la sfârșitul colorației.
• Filtrare inadecvată sau nu se folosește nici o filtrare a colorantului.

Prezența artefactelor morfologice

Artefacte morfologice pot apărea în frotiuri, ceea ce face dificilă vizualizarea și interpretarea structurilor prezente. Acest lucru se datorează:

• Tipul de anticoagulant utilizat, cum ar fi heparina.
• Utilizarea de filme murdare, deteriorate sau grase.

Mod de stocare

După preparare, colorantul trebuie păstrat la temperatura camerei (15 - 25 ° C), pentru a împiedica precipitația. Trebuie păstrat într-un recipient chihlimbar închis.

Referințe

1. Cannova D, Brito E și Simons M. Evaluarea tehnicilor de colorare pentru diagnosticul de Leishmaniază cutanată. Salus. 2016; 20 (2): 24-29.
2. Reactivi ITR PanReac Applichem. Pata de Giemsa. Versiunea 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Spania.
3. Clark G. Proceduri de colorare (1981), 4thed. Williams & Willkins.
4. Chimie clinică aplicată. Pata Giemsa pentru diagnostic in vitro. Distribuitor: cromakit.es
5. Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F și Grazioso C. Valabilitatea petelor de Giemsa și Lendrum în frotiuri conjunctivale pentru identificarea Chlamydia trachomatis. Bol din Sanit Panam. 1994; 116 (3): 212-216.
6. Casas-Rincón G. Micologie generală. 1994. Ediția a 2-a Universitatea Centrală din Venezuela, Ediții bibliotecare Venezuela Caracas.
7. "Pata Giemsa". Wikipedia, enciclopedia gratuită. 1 sept. 2017, 01:02 UTC. 6 decembrie 2018, es.wikipedia.org.