IMUNOFLUORESCENȚĂ: JUSTIFICARE, PROTOCOL ȘI APLICAȚII - BIOLOGIE - 2025

Imunofluorescența este o tehnică puternică imunocolorare folosind anticorpi legați covalent la molecule fluorescente pentru a identifica obiective specifice in probele de celule fixate pe un suport solid.

Această tehnică implică observarea microscopică cu specific imunologic, făcând posibilă observarea celulelor vii sau moarte care pot prezenta cantități minime de antigene. Este utilizat pe scară largă atât în ​​domeniul cercetării, cât și în diagnosticul clinic al diferitelor patologii.

Imunomarcarea filamentelor de actină în celulele cardiomiocitelor (Sursa: Ps1415 prin Wikimedia Commons)

Această tehnică, în principal calitativă (cu unele variante cantitative), are legătură specifică cu vizualizarea unui eșantion prin semnalul produsului unui fluorofor, care este o moleculă fluorescentă legată de un anticorp și care poate fi excitată la o anumită lungime de undă. .

În contextul celular este foarte util să studiem prezența / absența și localizarea subcelulară a proteinelor. Tehnica a fost folosită inițial în cadrul clinic pentru diagnosticul de virusuri precum gripa și, ulterior, pentru multe alte boli infecțioase.

Este o tehnică extrem de sensibilă și, cu echipamentul de microscopie adecvat, poate avea o rezoluție foarte bună. Necesită, pentru observarea sa, utilizarea microscopelor confocale sau epifluorescente.

Cu toate acestea, în ciuda faptului că este foarte popular, poate prezenta unele probleme importante în ceea ce privește obținerea unei fluorescențe nespecifice care generează un „zgomot” de fond, ceea ce deseori limitează citirea adecvată a rezultatelor.

Bază

Imunofluorescența se bazează pe exploatarea fenomenului biologic al reacției de interacțiune între un anticorp și un antigen. Ea are legătură specifică cu vizualizarea sau detectarea acestei reacții prin molecule fluorescente excitante la o lungime de undă specifică.

Un anticorp este o proteină imunoglobulină secretată din celulele B active, care este generată în mod specific împotriva unui antigen, de care se poate lega cu afinitate și specificitate ridicată. Imunofluorescența folosește imunoglobuline IgG, care se găsesc solubile în serul din sânge.

Anticorpii sunt molecule de până la 950 kDa alcătuite din două lanțuri peptidice (grele) cu formă „Y” de formă scurtă (ușoară) și două lungi. Atât lanțurile ușoare, cât și cele grele sunt împărțite în două domenii: unul variabil, capabil să recunoască antigenul, iar celălalt constant sau conservat, caracteristic fiecărei specii.

Antigenii sunt definiți funcțional ca molecule care pot fi recunoscute de un anticorp și sunt, în mare parte, proteine. Când un animal este expus la un antigen, limfocitele sistemului imunitar sunt activate, producând anticorpi specifici împotriva acestuia și funcționează ca un sistem de apărare.

Un antigen, cum ar fi o proteină, de exemplu, poate avea mai mult de un epitop sau loc de recunoaștere de către un anticorp, astfel încât serul animalului expus unui antigen să poată avea anticorpi policlonali împotriva diferitelor regiuni ale aceleiași proteine.

Apoi, imunofluorescența exploatează capacitatea unui animal de a produce anticorpi policlonali împotriva unui antigen specific pentru a-l purifica și, ulterior, a-l utiliza pentru detectarea aceluiași antigen în alte contexte.

Printre coloranții sau moleculele fluorescente cele mai utilizate pentru unele tehnici de imunofluorescență se numără izotiocianatul de fluoresceină (FITC), tetrametilrhodamina izotiocianat-5 și 6 (TRITC), multe cianine precum Cy2, Cy3, Cy5 și Cy7 și coloranți numiți Alexa Fluor® , cum ar fi Alexa Fluor®448.

Protocol

Protocolul de imunofluorescență variază în funcție de mulți factori, cu toate acestea, în termeni generali, el cuprinde o secvență liniară de etape constând din:

• Pregătirea plăcilor și a celulelor
• Fixarea probelor
• permeabilization
• blocarea
• Imunostaining sau imunostaining
• Adunarea și observarea

-Pregatirea

Dintre probe

Pregătirea eșantioanelor va depinde de natura lor și de tipul de experiență care urmează să fie realizat. Cel mai simplu caz, care presupune utilizarea celulelor în suspensie, va fi explicat mai jos.

Celulele în suspensie, adică într-un mediu de cultură lichidă, trebuie mai întâi separate de acesta prin centrifugare și apoi trebuie spălate cu o soluție tampon sau „tampon” izosmotic, care își păstrează integritatea.

În mod normal, se folosește un tampon fosfat-salin cunoscut sub numele de PBS, în care celulele sunt resuspendate și acest amestec este centrifugat din nou pentru a obține celulele libere de mediul de cultură, care poate conține substanțe interferențe.

Din lame

Diapozitivele utilizate pentru observarea microscopică, unde celulele vor fi ulterior fixate pentru tratamentele corespunzătoare din aval, trebuie de asemenea pregătite cu atenție.

Acestea sunt acoperite sau „sensibilizate” cu o soluție de poli-lizină, un polimer sintetic care va acționa ca un „lipici molecular” între celule și suportul solid, datorită interacțiunii electrostatice dintre încărcările pozitive ale grupărilor lor amino și sarcini negative asupra proteinelor care acoperă celulele.

Fixarea probelor

Acest proces constă în imobilizarea proteinelor găsite în interiorul celulei pentru a menține intacta locația spațială a acestora. Moleculele utilizate trebuie să poată traversa toate tipurile de membrane celulare și să formeze zăbrele cu proteinele covalente.

Formaldehida și paraformaldehida, glutaraldehida și chiar metanolul sunt utilizate pe scară largă, cu care probele de celule sunt incubate pentru un anumit timp și apoi spălate cu o soluție tampon izosmotică.

După fixarea celulelor, acestea continuă să fie atașate la foile sensibilizate anterior cu poli-lizină.

permeabilization

În funcție de tipul de test care se efectuează, va fi necesară permeabilizarea celulelor care sunt studiate sau nu. Dacă ceea ce se caută este să se cunoască locația, prezența sau absența unei anumite proteine ​​pe suprafața celulei, permeabilizarea nu va fi necesară.

Pe de altă parte, dacă doriți să cunoașteți locația unei proteine ​​în interiorul celulei, permeabilizarea este esențială și va consta în incubarea probelor cu Triton X-100, un detergent capabil să permeaze membranele celulare.

blocarea

Un pas fundamental în toate tehnicile imunologice este blocarea. În această etapă a procedurii, blocarea constă în acoperirea, pe foile sensibilizate, a tuturor locurilor cu molecule de poli-lizină la care celulele nu au aderat. Adică împiedică orice unire nespecifică.

În mod normal, soluțiile cu albumină serică bovină (BSA) în tampon PBS sunt utilizate pentru blocare și cele mai bune rezultate sunt obținute cu atât mai mult timp de incubație cu această soluție. După fiecare pas, inclusiv blocarea, este necesară spălarea soluției rămase.

Imunostaining sau imunostaining

Procedura de imunostanțare sau imunostanțare va depinde în principal de dacă este vorba despre o imunofluorescență directă sau indirectă (vezi mai jos).

Dacă este o imunofluorescență primară sau directă, eșantioanele vor fi incubate cu anticorpii doriți, care trebuie să fie cuplate la coloranții fluorescenti. Procedura de incubație constă în realizarea unei diluări a anticorpului într-o soluție care va conține, de asemenea, BSA, dar într-o proporție mai mică.

Atunci când cazul este cel al unei imunofluorescențe secundare sau indirecte, trebuie efectuate două incubări consecutive. Mai întâi cu anticorpii doriți și apoi cu anticorpii care sunt capabili să detecteze regiunile constante ale imunoglobulinelor primare. Acești anticorpi secundari sunt legați covalent la fluorofori.

Tehnica este foarte versatilă, permițând etichetarea simultană a mai mult de un antigen pe probă, atât timp cât există anticorpi primari cuplați la fluorofori diferiți, în cazul imunofluorescenței directe.

Pentru etichetarea simultană în imunofluorescență indirectă, este necesar să se asigure că fiecare anticorp primar este produs la un animal diferit, precum și că fiecare anticorp secundar este cuplat la un fluorofor diferit.

Ca și blocarea, incubația cu anticorpi dă rezultate mai bune cu cât timpul este mai lung. După fiecare etapă, este necesar să spălați excesul de anticorpi care nu s-au legat de probe și în imunofluorescența secundară este necesar să se blocheze înainte de a adăuga anticorpul secundar.

Anumite tehnici folosesc alte pete care nu au legătură cu imunostanțarea, cum ar fi colorarea ADN-ului nuclear cu fluoroforul DAPI.

Adunarea și observarea

În timpul perioadei finale de incubație cu fluoroforii, este necesar ca probele să rămână în întuneric. Pentru observarea la microscop, este obișnuit să se utilizeze unele substanțe pentru a păstra fluorescența fluoroforilor cuplat la anticorpi.

Tipuri

Rezumat grafic al imunofluorescenței directe și indirecte (Sursa: Westhayl618 prin Wikimedia Commons)

Imunofluorescență directă sau primară

Are legătură cu detectarea antigenelor prin utilizarea anticorpilor fluorescente. Principalul avantaj al utilizării acestei tehnici este viteza acesteia, cu toate acestea, multe cazuri de legare nespecifică pot apărea în proces, în special atunci când studiați seruri umane, deoarece sunt bogate în anticorpi extrem de eterogeni.

Imunofluorescență indirectă sau secundară

Este cunoscută și sub denumirea de tehnică „sandwich” și aceasta implică dezvoltarea tehnicii în doi pași. Primul lucru are legătură cu utilizarea unui anticorp non-fluorescent și legarea acestuia la antigenul de interes.

Față de regiunea constantă a acestui prim anticorp (care va servi acum ca antigen) se folosește un al doilea anticorp capabil să-l recunoască, care este asociat cu o moleculă fluorescentă.

Apariția unui semnal fluorescent va fi rezultatul recunoașterii specifice între primul anticorp ne fluorescent și antigenul de interes; prezența acestui prim anticorp îl condiționează pe cel de-al doilea, care este marcat și datorită căruia poate fi determinată prezența sau absența antigenului.

În ciuda faptului că este o tehnică care consumă mult mai mult timp decât imunofluorescența directă (deoarece include încă o etapă de incubație), această tehnică nu implică proiectarea unui anticorp fluorescent pentru fiecare antigen studiat, ceea ce rezultă, din punct de vedere economic, mai viabil.

Mai mult, este o tehnică mai sensibilă în ceea ce privește amplificarea semnalului, deoarece mai mult de un anticorp secundar se poate lega la regiunea constantă a anticorpului primar, amplificând astfel intensitatea semnalului fluorescent.

Aplicații

După cum s-a remarcat anterior, imunofluorescența este o tehnică extrem de versatilă, care a fost folosită în multe feluri în domeniile științific și clinic. Poate fi folosit pentru a răspunde la întrebări ecologice, genetice și fiziologice cu privire la multe organisme.

Printre aplicațiile clinice, este utilizat pentru diagnosticul direct al unor boli dermatologice, fie folosind imunofluorescență directă sau indirectă pe țesutul epitelial al pacienților studiați.

Tehnicile de imunofluorescență au fost disponibile în organismele unicelulare, cum ar fi drojdia, pentru a vizualiza microtubuli intranucleari și citoplasmici, actină și proteine ​​asociate, filamente de 10 nm și alți constituenți ai citoplasmei, membranei și pereților celulari.

Referințe

1. Abcam, imunocitochimie și protocol imunofluorescență. Preluat de pe abcam.com
2. Greph, C. (2012). Vopsele fluorescente. Preluat de la leica-microsystems.com
3. Miller, DM, și Shakest, DC (1995). Microscopie imunofluorescență. În Methods in Cell Biology (Vol. 48, p. 365–394). Academic Press, Inc.
4. Odell, ID, & Cook, D. (2013). Tehnici de imunofluorescență. Journal of Investigative Dermatology, 133, 1–4.
5. Princle, BJR, Adams, AEM, Druain, DG, & Brian, K. (1991). Metode de imunofluorescență pentru drojdie. În Metode de enzimologie (vol. 194, p. 565–602). Academic Press, Inc.
6. Schaeffer, M., Orsi, E. V, & Widelock, D. (1964). Aplicații ale imunofluorescenței în virusologia sănătății publice. Recenzii bacteriologice, 28 (4), 402–408.
7. Vrieling, EG, & Anderson, DM (1996). Imunofluorescență în cercetarea fitoplanctonului: aplicații și potențial. J: Phycol. , 32, 1–16.