PATA LUI WRIGHT: RAȚIUNI, MATERIALE, TEHNICĂ ȘI UTILIZĂRI - BIOLOGIE - 2025

Wright pata este o tehnica de colorare creat de americanul James patolog Homer Wright în 1902, bazat pe pata Romanowsky. Deoarece pata Romanowsky a fost instabilă, Wright a încorporat metanolul ca solvent și fixant.

Această colorare este policromatică, ceea ce înseamnă că generează mai multe culori în funcție de structura care absoarbe colorantul. Această tehnică de colorare a fost utilizată pe scară largă pentru efectuarea numărului diferențial de celule albe din sânge și pentru studierea morfologiei globulelor roșii, trombocitelor și leucocitelor din sângele periferic și măduva osoasă.

Diverse frotiuri de sânge periferic colorate cu pata lui Wright. A. Leucemie acută B. Plasmodium vivax în eritrocit. C. Plasmodium falciparum, macrogametocit. D. Limfocit

Aplicarea sa este foarte importantă, deoarece anomaliile pot fi observate în diferitele linii celulare ale sângelui, facilitând diagnosticul de boli precum leucemia sau infecții bacteriene sau parazitare.

Poate că acestea sunt cele mai frecvente aplicații în care se folosește această tehnică, cu toate acestea nu sunt singurele. De asemenea, este util în alte probe decât sângele și măduva osoasă, cum ar fi externarea nazală, mucusul fecal, spută, probe de piele, printre altele.

Motivul pentru pata lui Wright

Pata lui Wright s-a născut din pata lui Romanowsky, care constă dintr-o soluție de alcool metilic dintr-un colorant acid (eozină Y) și un colorant de bază (albastru de metilen) și produsele lor de oxidare.

Amestecul de coloranți folosiți în pata lui Wright provoacă efectul cunoscut sub numele de Romanowsky, adică dă o frumoasă colorație purpurie nucleelor ​​de leucocite și granule neutrofile, în timp ce globulele roșii colorați roz.

Componentele responsabile de oferirea gamei de culori tipice a petei lui Wright sunt albastrul B și eozina Y. Efectul observat va depinde de legarea coloranților de structurile chimice și de interacțiunile albastru B și eozină Y.

Structurile acide, cum ar fi acizii nucleici, proteinele nucleare și citoplasma imatură reactivă a unor tipuri de celule, fixează B albastru (pata de bază).

În timp ce structurile de bază precum hemoglobina, granulele eozinofilelor segmentate, printre alte structuri celulare, se leagă de eozina Y (colorant acid).

Rezultatul colorației poate fi influențat de diferiți factori, cum ar fi pH-ul colorantului Wright, tamponul și soluția de spălare; precum și timpul de colorare și fixare.

Prin urmare, fiecare etapă în pregătirea reactivilor este crucială și trebuie efectuată cu atenție la fiecare detaliu.

materiale

Pata lui Wright. Pentru 100 ml este necesar:

Se cântăresc 0,3 g de pata de Wright, se măsoară 97 ml de metanol și 3 ml de glicerol.

preparare

Într-un mortar, așezați cantitatea grea de colorant Wright și încorporați treptat glicerolul până la dizolvarea completă a pulberii.

Ulterior, se adaugă metanol, se amestecă și se toarnă într-o sticlă de chihlimbar.

Înainte de utilizare, soluția trebuie agitată cu mișcări blânde și filtrată.

Soluție tampon tamponată

Într - un litru de apă distilată, 3,76 g de hidrogenofosfat disodic (Na ₂ HPO ₄ 2H ₂ 0) plus 2,1 g de fosfat diacid de potasiu (KH ₂ PO ₄ sunt adăugate).

Se amestecă foarte bine până se dizolvă toți reactivii încorporați. Reglați pH-ul la 7.2. Se toarnă într-un borcan de sticlă și se păstrează la temperatura camerei.

Materiale suplimentare necesare pentru realizarea colorației

În plus, sunt necesare alte materiale pentru a putea efectua tehnica de colorare, acestea sunt: ​​diapozitive sau huse pentru obiecte, punte de colorat, tricouri cu apă sau tampon pentru spălare, un cronometru pentru a păstra timpii de colorare și unele materiale de uscare (hârtie absorbantă, tifon sau bumbac).

Componentele petei lui Wright

metanol

Alcoolul (metanolul) servește ca fixant al frotiei de sânge la diapozitiv.

Este practic un reactiv de reducere, deshidratare și fixare a coagulantului. Prin urmare, funcția sa este de a coagula proteinele și de a le face insolubile, dar fără a le denatura.

Metanolul este cel mai utilizat reactiv de fixare a frotierelor în toate laboratoarele, deoarece oferă rezultate mai bune decât etanolul. Concentrația ideală este de 99%.

Amortizor

Tamponul (soluție tamponată) are funcția de a ajusta sau menține pH-ul colorantului, deoarece un pH ajustat la 7.2 este esențial pentru ca structurile celulare să poată absorbi coloranții în mod corespunzător.

Pe de altă parte, etapa de fixare a metanolului deshidratează celulele, iar tamponul ajută la rehidratarea lor.

Eosin (Y)

Eosin are o afinitate pentru blocurile de construcție, deoarece este un colorant acid. Două tipuri de eozină sunt cunoscute foarte asemănătoare între ele, atât de mult încât fiecare dintre cele două poate fi utilizat, obținând același rezultat.

Unul se numește eozină Y, eozină galbenă sau tetrabromofluoresceină, iar celălalt se numește eozină B, eritrosină albăstruie B sau dibromodinitrofluoresceină. Cu toate acestea, eozina Y este cea mai frecvent utilizată.

Cea mai importantă proprietate a acestui colorant este polaritatea sa negativă, ceea ce îl face atras de structurile celulare încărcate pozitiv.

Albastru de metil

Este colorarea de bază. Proprietatea sa principală este metachromasia, adică nu toate structurile vor fi pătate de aceeași culoare, depinde de compoziția chimică a structurilor pe care le colorați.

Unele vor deveni albastru deschis sau albastru închis, iar altele vor deveni violet închis sau liliac palid.

Tehnică

1-Efectuați răspândirea eșantionului astfel încât să rămână o peliculă subțire, fie pe o lamelă, fie pe un capac.

2-Lăsați-l să se usuce în aer aproximativ 2 ore.

3-Așezați frotiul uscat pe podul de colorare sau tava de colorare cu întinderea probei orientată în sus.

4-Acoperiți foaia cu pata de Wright picătură cu picătură până când întreaga suprafață este acoperită. Lăsați-l timp de 5 - 8 minute.

5-Pata trebuie să acopere complet diapozitivul, fără a vărsa pe margini. Dacă în perioada de colorare începe să se evapore, adăugați câteva picături suplimentare.

6-Apoi adăugați o cantitate egală de amortizor, suflați puțin până când apare strălucirea metalică caracteristică. Timp de 10-15 minute.

7-Spălați cu apă de la robinet, punând fluxul blând până când foaia arată roz.

8-Cu un tifon înmuiat în alcool, îndepărtați colorantul aderat pe partea din spate a lamelului.

9-Lăsați frotiul să se usuce foarte bine înainte de a pune uleiul de imersiune pentru a-l vizualiza sub microscop.

Utilitate

Hematologie

Este ideal pentru colorarea frotiilor de sânge periferic, pentru examinarea frotilor de sânge gros și pentru studiul celulelor din probe de măduvă osoasă.

Datorită proprietăților chimice ale acestei combinații de coloranți, structurile celulare pot fi ușor recunoscute și se pot distinge diferitele tipuri de celule prezente.

Nasul curgător

Această tehnică este foarte utilă pentru identificarea celulelor de descărcare nazală (celule epiteliale, eozinofile segmentate, celule polimorfonucleare) în diagnosticul rinitei alergice.

parazitologie

În acest sens, a fost util pentru studiul Leishmania sp în histiocitele țesutului celular subcutanat în ulcerațiile pielii. De asemenea, este utilizat pentru identificarea leucocitelor în probele de scaun (leucograma fecală).

În acest caz, este de interes pentru medic să știe dacă leucocitoza prezentă în scaun este polimorfonucleară sau mononucleară. Această constatare în leucograma fecală va ghida dacă este vorba de o infecție bacteriană sau virală.

Pe de altă parte, paraziții care circulă în sânge pot fi găsiți în eritrocit sau liber în plasmă. Paraziții căutați sunt Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii și filariae, iar în medicina veterinară este utilă în căutarea Theileria equi și Babesia caballi, agenți cauzali ai bebesiozei, în special la cai.

Pata Wright și, de asemenea, pata Giemsa fac posibilă diferențierea hemoparaziților de componentele celulare normale. Pentru aceasta pot fi utilizate două tipuri de spread:

Întindeți subțiri

Sângele este răspândit ca o peliculă subțire pe un diapozitiv. Este colorată cu pata lui Wright, dezvăluind caracteristicile nucleului și citoplasmei.

Picătură groasă

Această metodologie este utilizată pentru a investiga prezența paraziților într-o cantitate mai mare de sânge.

Pentru a face acest lucru, o picătură mare de sânge este plasată pe o lamelă. Odată ajuns acolo, trebuie defibrilat, făcând cercuri mai mari și mai mari de la centru spre exterior, folosind marginea unei alte diapozitive.

În cele din urmă, pentru a putea observa paraziții din frotiul gros, eritrocitele trebuie lizite cu apă.

Infecție respiratorie

La nivel respirator, această tehnică este utilă, deoarece celulele prezente în probele de spută, lavaj bronșic sau bronhoalveolare, sunt importante pentru stabilirea diagnosticului.

În mod similar, celulele polimorfonucleare și celulele mononucleare pot fi diferențiate aici.

Bacteriologie

Utilizarea acestei tehnici în bacteriologie este limitată, deoarece nu este bună pentru colorarea bacteriilor, motiv pentru care sunt folosite alte tehnici de colorare specializate pentru colorarea lor.

Cu toate acestea, a fost utilizat pentru a căuta celule epiteliale cu corpuri de incluziune Chlamydia trachomatis în frotii ale mucoasei uretrale sau endocervicale, deși trebuie recunoscut că nu este cea mai bună metodă pentru aceasta.

De asemenea, este posibilă observarea bacteriilor în formă de spirală, cum ar fi Borrelia burgdorferi, printre celulele roșii din sânge la pacienții infectați, precum și morule sau corpuri de incluziune ale Ehrlichia sp în citoplasma limfocitelor, monocitelor sau neutrofilelor într-un frotiu de sânge.

Micologie

Histoplasma capsulatum este o ciupercă patogenă frecvent diagnosticată prin observarea microscopică a diverselor probe de țesut, colorată cu pata de Wright.

Cum sunt observate structurile probei de sânge cu pata lui Wright?

Sursa: Retamales E, Mazo V. Institutul de Sănătate Publică, Guvernul Chile. Recomandări pentru colorarea frotiilor de sânge pentru citirea hemogramei.

Recomandări pentru o colorare bună

Diapozitivele de sânge trebuie să se usuce spontan. Frotile trebuie să fie cât mai subțiri pentru a obține o mai bună fixare a colorantului și a evita supra-colorarea.

Pentru colorarea de înaltă calitate, se recomandă colorarea în două ore de la prepararea frotiei. Pe de altă parte, proba ideală este sângele capilar, fără anticoagulant.

Cu toate acestea, dacă se utilizează sânge venos, acesta trebuie utilizat ca anticoagulant EDTA și nu heparină, deoarece acesta din urmă poate deforma structurile celulare.

Pentru a evita deteriorarea colorantului preparat, acesta trebuie păstrat în locuri uscate.

În timpul procesului de spălare este recomandată utilizarea apei reglată la un pH neutru.

În cele din urmă, este recomandabil să testați din când în când metodele de colorare utilizate în laborator.

Acest lucru se realizează prin colorarea probelor sau a modelelor extinse, ca un control al calității. Această etapă este importantă, deoarece asigură pregătirea corectă a colorației și timpii de colorare sunt bine standardizați.

Dacă foaia de model este slab colorată, atunci există probleme care trebuie rezolvate.

Greșeli frecvente în colorarea Wright

Pata foarte palida

Froturile foarte palide se datorează de obicei unui timp de colorare foarte scurt sau unei spălări excesive. Se corectează prin prelungirea timpului de contact cu vopsea sau prin reducerea timpului de spălare.

Colorantul precipită

Prezența precipitațiilor de vopsea în frotiu poate avea mai multe cauze, cu toate acestea, cele mai frecvente cauze sunt: ​​utilizarea de coloranți nefiltrați, colorarea pe poduri de colorare neuniformă, utilizarea de foi murdare cu praf sau grăsime, fără a face o spălare bună atunci când colorare completă.

Frotiu extrem de roșu sau albastru

Tamponul este responsabil pentru pH-ul colorantului. Coloranții cu un pH sub cel indicat (acid) vor duce la frotiuri foarte roșiatice.

Dacă pH-ul colorantului este peste (alcalin), se va obține un frotiu extrem de albăstrui.

Mod de stocare

Reactivul trebuie păstrat la temperatura camerei.

Referințe

1. Gutiérrez V. Studiu comparativ între metoda de colorare Wright și testul Elisa pentru diagnosticul de eclichioză canină în orașul San Pedro Sula, Honduras. 2008. Teza de licență pentru a beneficia de gradul medical veterinar. Universitatea din San Carlos din Guatemala.
2. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Petele de bază în laboratorul de microbiologie. Cercetări în domeniul dizabilității. 2014; 3 (1): 10-18.
3. „Pata lui Wright”. Wikipedia, enciclopedia gratuită. 18 mai 2018, ora 12:05 UTC. 8 Dec 2018, ora 20:37
4. Calderón A, Cardona J, Vergara Ó. Frecvența Babesia spp. la vânătoare de cai, Córdoba (Columbia). Rev. udcaactual divulgare eficientă. 2013; 16 (2): 451-458.
5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Diagnostic microbiologic Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana SA
6. Retamales E, Mazo V. Institutul de Sănătate Publică Guvernul Chile. Recomandări pentru colorarea frotiilor de sânge pentru citirea hemogramei.