SECVENȚIERE ADN: MAXAM-GILBERT, METODĂ ȘI EXEMPLE - BIOLOGIE - 2025

Secventiere ADN (acid dezoxiribonucleic) este o procedură în laboratoare de biologie moleculară , care permite să cunoască ordinea de nucleotide în materialul genetic de interes. Mai mult, secvențialul ARN (acid ribonucleic) poate fi, de asemenea, dezvăluit.

Această tehnică a fost indispensabilă pentru dezvoltarea științelor biologice. De asemenea, se aplică și altor domenii de cunoștințe - cum ar fi diagnosticul medical și investigațiile medico-legale, de exemplu.

Sursa: pixabay.com

Anterior, secvențierea unei catene de ADN a fost considerată o activitate lentă și scumpă, ceea ce a permis identificarea doar a câtorva perechi de baze în oligonucleotide.

Astăzi, cu toate progresele din știință, secvențierea ADN-ului este o operație de rutină în multe laboratoare din întreaga lume datorită contribuției a aproape 50 de ani de cercetare în acest domeniu. În ceea ce privește lungimea lanțului, până la milioane de perechi de baze pot fi secvențiate într-un timp foarte scurt.

Pentru a face acest lucru, există zeci de tehnici dezvoltate care variază ca preț și precizie. În acest articol, vom descrie atât tehnici clasice, cât și moderne, fiecare cu avantajele și dezavantajele sale.

Până acum, tehnicile de secvențiere permit obținerea secvenței genomului complet, de la procariote mici și drojdii la genomul uman.

Structura ADN-ului

Pentru a înțelege metodele și tehnicile utilizate pentru secvențierea ADN-ului, este necesar să cunoaștem anumite aspecte cheie ale structurii și compoziției moleculei.

ADN-ul este o biomoleculă găsită în toate ființele vii, de la bacterii la animale acvatice mari. Organulele - ca mitocondriile și cloroplastele - au o moleculă circulară de ADN în interiorul lor. Chiar și la unele virusuri, materialul genetic găsit este ADN-ul.

Structural, ADN-ul este o colecție de nucleotide. Fiecare este format dintr-un carbohidrat, o bază azotată (A, T, C sau G) și o grupare fosfat. Scopul secvențierii ADN-ului este de a dezvălui ordinea în care se găsesc cele patru baze azotate în secvență.

Istorie

La mijlocul anilor '50, cercetătorii Watson și Crick au descris structura ADN-ului folosind tehnici cristolografice. Cu toate acestea, niciunul dintre acești cercetători nu a fost în stare să găsească o modalitate de a descoperi secvența.

Deși au existat anumiți predecesori, cel mai important eveniment a fost crearea metodei Sanger, în 1977. Frederick Sanger, tatăl metodei, a fost un biochimist britanic, câștigător a două premii Nobel pentru contribuțiile sale enorme la științele biologice.

Această tehnică este cunoscută și în literatura de specialitate sub denumirea de „terminarea lanțului” sau a dideoxinucleotidelor. Principiile acestei tehnici și cele care au fost dezvoltate pe baza îmbunătățirii și inovației sale vor fi descrise mai jos.

Metoda Sanger

Dezvoltarea metodei Sanger a reprezentat un eveniment crucial în biologia moleculară. Ea implică componentele de bază ale procesului de replicare a ADN-ului care apare în mod normal în celulă, dar adăugând o componentă specială: dideoxinucleotide.

Principalele componente ale reacției

- ADN polimeraza: enzima ADN polimeraza este un element crucial al procesului. Această moleculă participă la replicarea catenei de ADN, iar rolul său este sinteza noii catene, împerecheând dezoxiribonucleotidele trifosfat cu cele complementare.

Reamintim că în ADN, timinele (T) se împerechează cu adenine (A) prin două legături de hidrogen, în timp ce citosina (C) face acest lucru cu guanina (G) prin trei legături.

- Nucleotide: Secvențializarea pericolului implică două tipuri de nucleotide, cele patru 2'-deoxinucleotide (prescurtate ca dATP, dGTP, dCTP și dTTP) și cele patru dideoxinucleotide speciale (ddATP, ddGTP, ddCTP și ddTTP).

Deși dideoxinucleotidele sunt similare cu monomerii care sunt în mod normal încorporați în ADN, le lipsește o structură -OH în structura lor. Acest lucru face imposibilă adăugarea unui nou nucleotid în lanț.

Prin urmare, când se adaugă un nucleotid special - într-un mod total aleatoriu - lanțului în formare, sinteza este paralizată. Astfel, la sfârșitul reacției, există lanțuri de diferite dimensiuni, fiecare în care reacția a fost oprită într-un punct diferit.

Experimental, sunt pregătite patru teste. Fiecare conține ADN-ul extras din proba biologică de interes, nucleotidele normale și unul dintre cele patru tipuri de nucleotide speciale. Fie nucleotidele speciale sunt marcate cu un tip de marker fluorescent (vezi secvențiere automată mai jos).

Citirea rezultatelor

Primul pas este separarea fiecăreia dintre lanțurile sintetizate în funcție de mărimea lor. Unele vor fi mai lungi decât altele, în funcție de locul în care au fost încorporate bazele speciale.

Există diferite tehnici biochimice care permit separarea componentelor unui amestec folosind dimensiunea ca proprietate discriminatorie. În metoda lui Sanger, diferitele lanțuri sunt separate prin electroforeză. În variantele mai sofisticate ale tehnicii se folosește electroforeza capilară.

Astfel, catenele mai lungi călătoresc mai puțin decât variantele mai scurte. Acest sistem trece apoi printr-un cititor care recunoaște markerul inclus în fiecare dideoxinucleotidă. În acest fel, ordinea secvenței poate fi cunoscută.

Această tehnică „din prima generație” este capabilă să citească fragmente de ADN nu mai mari de 1 kilobază. În prezent, metoda Sanger este folosită în diferite laboratoare, în general în variantele sale moderne. În plus, este utilizat pentru a corobora rezultatele obținute cu cele mai complexe tehnici - dar mai puțin precise.

Secvențiere automată

Atunci când este necesară secvențarea pe scară largă, procesul este accelerat prin automatizare. Aceasta este o variație a metodei de terminare a lanțului Sanger, unde primerii sunt etichetați cu produse fluorescente pentru a le distinge.

Ulterior, produsul de reacție este rulat într-o electroforeză - totul pe o singură bandă. Pe măsură ce fiecare fragment iese din porțiunea finală a gelului, este identificat rapid prin etichetarea fluorescentă, cu o eroare în jurul valorii de 1%.

Cele mai sofisticate sisteme au un sistem de până la 96 de tuburi capilare gestionate de un computer cuplat la un robot. Adică 96 de probe de ADN pot fi testate simultan. Astfel, procesul care implică electroforeza și analiza rezultatelor este complet automatizat.

Într-o zi, aceste sisteme pot secvența până la 550.000 de baze. În timpul procesului, munca umană nu este necesară, este nevoie de aproximativ 15 minute pentru a începe metoda.

Secvențiere Maxam-Gilbert

În același timp în care Sanger și-a publicat lucrările, doi cercetători numiți Allan Maxan și Walter Gilbert au reușit să dezvolte o altă metodă pentru a obține secvența ADN. Metoda a câștigat popularitate la acea vreme, dar a fost ulterior deplasată prin îmbunătățirea metodei lui Sanger.

Spre deosebire de metoda Sanger, secvențializarea Maxan și Gilbert (sau secvențiere chimică, așa cum se știe și ea) nu implică reacții de hibridizare. Metodologia constă în etichetarea cu agenți reactivi la un capăt, urmată de un proces de purificare.

Unul dintre aspectele negative ale acestei tehnici constă în enorma sa complexitate și în utilizarea substanțelor chimice periculoase pentru utilizator. Pauzele chimice sunt induse prin aplicarea de DMS, acid formic, hidrazină și hidrazină cu săruri.

Proces

Protocolul începe cu etichetarea la capătul 5 'al firului cu markerul de fosfor 32, apoi are loc o modificare chimică a bazei de azot și este separată. În cele din urmă, apare clivajul regiunii abazice.

Mai întâi scurtați șirul pe care doriți să îl secundați în segmente mai mici. Această etapă este realizată cu enzime de restricție, care au ca rezultat capete proeminente.

În continuare, reacția este realizată cu o fosfatază alcalină, al cărei scop este eliminarea grupei fosfat. Astfel, o polinucleotidă kinază poate fi utilizată pentru a efectua etichetarea.

Lanțul este denaturat (cele două fire sunt deschise). Apoi se aplică substanțele chimice. Aceste reacții de clivaj se fac într-un mod controlat și se știe ce tipuri de legături se rupe fiecare produs chimic aplicat.

Citirea rezultatelor

Ca și în metoda Sanger, citirea rezultatelor implică separarea prin mărime a lanțurilor obținute într-un sistem de electroforeză. Sistemele compuse din poliacrilamidă permit obținerea unei rezoluții foarte adecvate pentru citirea gelului.

Secvențiere în masă

Secvențarea masivă cuprinde o serie de metode noi, prescurtate ca NGS, din engleza „Next Generation Sequencing”.

Metodele clasificate ca NGS necesită o etapă anterioară de amplificare a ADN-ului (nu funcționează cu o singură moleculă). Mai mult, platformele utilizate variază foarte mult. Principiile celor mai populare metode vor fi descrise mai jos:

pyrosequencing

Ea implică monitorizarea eliberării unui pirofosfat, care apare de fiecare dată când se adaugă un nucleotid nou la catenele ADN. Un sistem de enzime este cuplat, astfel încât emisia de lumină (care poate fi detectată de o cameră) are loc de fiecare dată când este încorporată o nouă nucleotidă.

Procesul începe cu incubarea separată a fiecărei baze de azot pentru a verifica dacă există sau nu emisii de lumină. Pirosecvenția poate citi șiruri lungi, dar rata de eroare găsită este mare.

Secvențiere de sinteză

Aceasta implică încorporarea de nucleotide marcate. Aceste componente fluorescente sunt adăugate, spălate și notate nucleotidele încorporate. Apoi, eticheta nucleotidică este îndepărtată, iar sinteza catenei poate continua. În următoarea etapă, se va încorpora și un nucleotid marcat, iar etapele menționate anterior se vor repeta.

Un dezavantaj al acestei tehnici apare atunci când markerii fluorescenți nu sunt îndepărtați complet. Aceste emisii creează erori de fond, rezultând erori semnificative.

Secvențiere a ligamentelor

Această tehnică diferă de celelalte, deoarece nu folosește ADN polimeraza. În schimb, enzima cheie pentru această metodologie este ligaza. Aici, sunt utilizate fragmente de ADN marcate fluorescent, este legată de enzimă și este detectată.

Cea mai mare problemă a acestei tehnici este lungimea scurtă a fragmentului pe care este capabil să o prelucreze.

Secvențiere de torrenturi Ion

Această tehnică se bazează pe măsurarea ionului H ⁺ care este eliberat de fiecare dată când este încorporat un nou nucleotid. Principiul este destul de similar cu pirosecvenția, dar mult mai ieftin.

Exemple

Secvențializarea genomului uman

Secvențializarea genomului uman a fost una dintre cele mai promițătoare provocări în biologie, precum și a fost una dintre cele mai apreciate rivalități din istoria științei. De fapt, pentru oamenii de știință implicați în proiect, secvențarea genomului a devenit o competiție.

În 1990 a început ceea ce a fost numit „proiectul genomului uman”, condus de celebrul om de știință, câștigător al Premiului Nobel, James Watson. După un an, în 1991, Venter își asumă provocarea de a-l „învinge” pe Watson și de a secenționa genomul înaintea lui. Cu toate acestea, în 1992, Watson s-a retras și comanda a fost luată de un alt cercetător.

În 1995, Venter și-a anunțat succesul în secvențializarea completă a unui genom bacterian prin metoda secvențării aleatorii. În mod similar, echipa adversă a anunțat un an mai târziu secvențierea genomului drojdiei.

În 2000, gradul a fost încheiat. Ambele companii au publicat rezultatele preliminare ale genomului lor în două dintre cele mai prestigioase reviste ale științei: Natura și Știința.

Cu toate acestea, oamenii de știință au continuat să lucreze la îmbunătățirea propunerilor, iar în 2006 secvențele anumitor cromozomi umani au fost finalizate.

Importanță și aplicații

Cunoașterea ordinii nucleotidelor unei molecule atât de importante precum ADN-ul este valoros pentru biologi și profesioniști înrudiți. Acest lanț de polinucleotide conține toate informațiile necesare dezvoltării și întreținerii tuturor formelor de viață.

Din aceste motive, cunoașterea acestei secvențe este esențială pentru cercetarea biologică. În mod fundamental, secvențierea permite măsurarea uneia dintre cele mai importante proprietăți ale sistemelor biologice și stabilirea diferențelor între ele.

Secvențializarea este folosită pe scară largă de către taxonomiști și sistematici, deoarece anumite secvențe ADN permit stabilirea criteriilor pentru a concluziona dacă două organisme aparțin sau nu aceleiași specii, pe lângă faptul că pot propune ipoteze despre relațiile filogenetice dintre ele.

În plus, secvențierea ADN-ului are aplicații în medicină și diagnostic. De exemplu, există sisteme ieftine și accesibile care, prin secvențiere, fac posibilă evaluarea tendinței de a dezvolta anumite boli (cum ar fi cancerul) folosind așa-numitele polimorfisme cu un singur nucleotid (SNP).

Investigațiile de tip criminal și criminalistic au fost, de asemenea, îmbogățite cu tehnici de secvențiere, care pot fi utilizate ca dovezi fiabile ale participării unei anumite persoane la o infracțiune.

Referințe

1. Heather, JM, & Chain, B. (2016). Secvența secvențiatorilor: istoricul secvențierii ADN-ului. Genomica, 107 (1), 1-8.
2. Koboldt, DC, Steinberg, KM, Larson, DE, Wilson, RK, & Mardis, ER (2013). Revoluția de secvențiere de generație următoare și impactul acesteia asupra genomicii. Celulă, 155 (1), 27-38.
3. Levy, J. (2010). Rivalități științifice. De la Galileo la proiectul genomului uman. Editorial Paraninfo.
4. Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, AR (1977). Secvențiere ADN cu inhibitori de terminare a lanțului. Proceedings of the national academy of sciences, 74 (12), 5463-5467.
5. Schuster, SC (2007). Secvențiere de generație următoare transformă biologia de astăzi. Metode de natură, 5 (1), 16.
6. Xu, J. (Ed.). (2014). Secvențiere de generație următoare. Presa Academică Caister.