MÜELLER HINTON AGAR: BAZĂ, PREGĂTIRE ȘI UTILIZĂRI - BIOLOGIE - 2025

Mueller Hinton Agar nu este mediu nutritiv selectiv, solid este compus din infuzie de carne, peptonă cazeină acidă, amidon, agar și apă distilată. Acest mediu permite o creștere microbiană excelentă pentru majoritatea bacteriilor cu creștere rapidă.

Acesta a fost inițial creat de John Howard Müeller și Jane Hinton pentru a izola bacteriile care necesită nutriție, precum Neisseria gonorrhoeae și Neisseria meningitidis. Cu toate acestea, datorită caracteristicilor sale, sa dovedit a fi ideal pentru studiul susceptibilității la antibiotice, oferind rezultate fiabile și reproductibile.

Antibiograme (agar Müeller Hinton). Sursa: Dr. Graham Beards la en.wikipedia

Prin urmare, agerul Müeller Hinton este mediul de cultură acceptat de Institutul de Standarde Clinice și de Laborator (CLSI) și de Comitetul European pentru Testarea Antimicrobiană a Susceptibilității, pentru efectuarea testului de susceptibilitate antimicrobiană prin metoda de difuzie a discului Kirby și Bauer.

Bază

Fiind un mediu nutritiv neselectiv, este excelent pentru creșterea majorității bacteriilor patogene.

Pe de altă parte, compoziția sa simplă face ca substanțele să difuzeze cu ușurință asupra acesteia, fiind o caracteristică esențială pentru testul de sensibilitate prin metoda de difuzie a discului.

O altă dintre caracteristicile sale este că conține o cantitate redusă de inhibitori, ceea ce permite evaluarea eficientă a sulfonamidelor, trimetoprimului și tetraciclinelor.

Cu toate acestea, trebuie avut în vedere faptul că mediul trebuie să îndeplinească anumite condiții pentru a-și asigura funcționarea corectă, inclusiv:

Reglarea pH-ului, adâncimea agarului și concentrația corespunzătoare de timină, timidină, Ca ⁺⁺ , Mg ⁺⁺ și Zn ⁺⁺ .

De asemenea, trebuie să știți că metodologia este standardizată și, prin urmare, toți parametrii trebuie îndepliniți, cum ar fi:

Concentrația inoculului, concentrarea și conservarea discurilor de antibiotice, plasarea numărului adecvat de discuri pe agar, distanța dintre un disc și altul, amplasarea strategică a anumitor antibiotice, atmosfera, temperatura și timpul de incubare.

preparare

Se cântăresc 37 g de mediu Müeller Hinton deshidratat și se dizolvă într-un litru de apă distilată. Se încălzește mediul în timp ce se agită pentru a ajuta la dizolvare. Se fierbe 1 minut.

Autoclave pentru a steriliza la 121 ° C timp de 15 minute. La scoaterea din autoclav, vasul trebuie plasat într-o baie de apă la 50 ° C pentru a se răci. Turnați 25-30 ml în vasele Petri sterile cu diametrul de 10 cm.

Plăcile trebuie să aibă o grosime medie de 4 mm (ideal), fiind permisă o gamă de 3-5 mm.

Dacă se dorește să se pregătească agar de sânge folosind agerul Müeller Hinton ca bază, se toarnă 5% sânge de miel steril și defibrinat înainte de a se servi pe farfurii.

PH-ul final al mediului trebuie să fie cuprins între 7,2 și 7,4.

Investiți și depozitați într-un frigider, până la utilizare. Lăsați placa să ajungă la temperatura camerei înainte de utilizare.

Culoarea mediului preparat este bej deschis.

Aplicații

Acesta este utilizat pentru a efectua antibiograma sau testul de sensibilitate la antibiotice pentru majoritatea agenților patogeni care nu necesită o creștere rapidă.

Dacă agarul este completat cu sânge, este utilizat pentru a efectua antibiograma microorganismelor solicitante, cum ar fi: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, printre altele. De asemenea, a fost folosit pentru izolarea Legionella pneumophila.

Tehnica antibiogramei

Înainte de a efectua antibiograma, trebuie pregătită o soluție bacteriană echivalentă cu 1,5 x 10 ⁸ celule.

Pentru aceasta, 3 până la 4 colonii de cultură pură sunt luate și suspendate într-un bulion de tripticază de soia sau în bulionul Müeller Hinton, incubate timp de 2 până la 6 ore și concentrația este ajustată cu soluție salină sterilă, comparând-o cu un standard Mac Farland de 0,5%.

Dacă solicită microorganisme, coloniile pot fi suspendate direct până la o concentrație de 0,5% Mac Farland. Ulterior, placa Müeller Hinton este însămânțată cu un tampon impregnat cu soluția bacteriană pregătită.

Pentru a face acest lucru, tamponul este scufundat în soluție și apoi excesul de lichid este îndepărtat prin apăsarea pe pereții tubului. Imediat după, tamponul este trecut pe întreaga suprafață, fără a lăsa locurile neatinse, apoi placa este ușor rotită și este însămânțată din nou. Operația se repetă de încă 2 ori.

Lăsați să stea 10 minute și apoi introduceți discurile de antibiotice cu un forceps steril, lăsând un spațiu de 24 mm între ele. După plasarea fiecărui disc pe agar, apăsați ușor fiecare disc cu forcepsul pentru a vă asigura că aderă bine.

După terminarea procesului, placa este inversată și incubată la 35-37 ° C în aerobioză timp de 16 până la 18 ore. Dacă este un microorganism solicitant, poate merita microaerofilie și dacă antibiograma conține discuri de oxacilină, trebuie citită după 24 de ore.

O riglă este utilizată pentru a măsura diametrul fiecărui hal. Rezultatele trebuie înregistrate în mm. Ulterior, valorile obținute sunt corelate cu tabelele punctelor de întrerupere publicate de manualul CLSI curent.

Măsurarea halogenului de inhibiție. Sursa: USCDCP, Pixnio.com

Raportați ca sensibil (S), intermediar (I) sau rezistent (R), după caz.

Antibioticele sunt selectate în funcție de microorganismul izolat și de tipul de infecție pe care îl produce.

Uneori, trebuie să se țină cont de plasarea strategică a antibioticelor pentru a dezvălui tipare fenotipice de rezistență.

Amplasarea discurilor strategice pe agarul Müeller Hinton

Pentru enterobacterii, discul de acid clavulanic trebuie plasat împotriva cefalosporinelor de generația a 3-a și a 4-a. O lărgire în formă de ou indică faptul că tulpina este un producător de beta-lactamaze cu spectru extins (ESBL). Aceasta înseamnă că pacientul nu trebuie tratat cu cefalosporine.

Expresia fenotipică a producției de beta-lactamază cu spectru extins într-o tulpină de Escherichia coli. Sursa: Fotografie realizată de autor MSc. Marielsa gil

În stafilococ este important să așezați discul de eritromicină sau azitromicină în fața discului de clindamicină (testul D).

Un halou rezistent în eritromicină și o aplatizare în halo de clindamicină indică faptul că tulpina are rezistență inductibilă la clindamicină (ICR). Aceasta înseamnă că un tratament cu clindamicină nu va fi eficient.

Pentru a căuta tulpini de AMP C inductibile în Enterobacteriaceae și unele tije Gram negative ne fermentante, tazobactan ceftazidime, cefoxitin sau discuri de piperacilină se confruntă cu un disc imipenem, la o distanță de 27 mm.

Un halou aplatizat într-unul dintre discurile cu care se confruntă imipenem indică prezența AMP C. inductibilă.

Pentru căutarea AMP C constitutivă, un disc de 500 ug cloxacilină este confruntat cu ceftazidime (30 pg) și cu cefotaximă (30 pg), la o distanță de 25 mm. Un halo lărgit în oricare dintre cefalosporine indică pozitivitate.

Discul cloxacilină poate fi de asemenea înlocuit cu un disc de 9 mm de hârtie de filtru Whatman nr. 6 impregnat cu acid fenil boric (400 pg) cu o distanță de 18 mm. Se interpretează la fel ca și precedentul.

În cele din urmă, pentru a investiga producția de metalobetalactamaze, în special în Pseudomonas aeruginosa, se folosește un disc impregnat cu 10 ul de acid etilenediaminetetraacetic (EDTA 750 pg) și acid tioglicolic (SMA 300 pg), care se confruntă cu discurile imipenem și meropenem, la o distanță de 15 mm.

Testul este pozitiv dacă există o lărgire a halopului imipenem sau meropenem către discul EDTA / SMA. Acest rezultat trebuie confirmat prin testul Hodge modificat.

Această metodă constă în inocularea unei tulpini de ATC 25922 de Escherichia coli pe placa Müeller Hinton. Un disc imipenem este plasat în centrul plăcii și apoi se face o dungă de pe disc la periferie cu tulpina suspectată de P. aeruginosa. Se pot testa până la 4 tulpini pe placă.

Testul va fi pozitiv dacă există o zonă de denaturare a imipenem halo în jurul vergetului.

Cauzele rezultatelor eronate

- Discurile antibiotice slab conservate pot produce rezistență falsă. De exemplu, discul de oxacilină este foarte vulnerabil la schimbările de temperatură.

-Un pH de mediu sub cel indicat (acid) produce halos mai mici în aminoglicozide și macrolide (risc de falsă rezistență) și halos mai mare în penicilină, tetraciclină și novobiocină (risc de sensibilitate falsă).

-Dacă pH-ul este peste cel indicat (alcalin), efectele descrise mai sus sunt inversate.

-Media cu concentrații mari de timină și timidină au o influență prin reducerea semnificativă a halosului de inhibiție a sulfonamidelor și trimetoprimului.

-Concentrațiile mari de calciu și magneziu produc o rezistență falsă la aminoglicozide, polimixină B și tetracicline împotriva tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa.

-Concentrațiile scăzute de calciu și magneziu produc sensibilități false ale aminoglicozidelor, polimixinei B și tetraciclinelor împotriva tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa.

-Prezența zincului afectează rezultatele discurilor carbapenem (imipenem, meropenem și ertapenem).

-Grosimea mediului sub 3mm va produce rezultate false de sensibilitate, în timp ce grosimea peste 5 va produce rezistență falsă.

-Mobilizarea discurilor din antibiogramă va da halos deformat, deoarece externarea antibioticelor este imediată.

- Inoculele foarte slabe afectează rezultatele, deoarece nu va exista o creștere uniformă sau confluentă în agar, o condiție necesară pentru a putea măsura halosul de inhibiție, pe lângă faptul că halosul poate da mai mare decât normal.

-Inocula încărcată excesiv poate da halos mai mic decât în ​​mod normal.

-Nu respecta distanța dintre discuri face ca un halo să se suprapună cu altul și acestea nu pot fi citite corect.

-Incubarea cu CO ₂ crește dimensiunea halosului discurilor de tetraciclină și meticilină.

-Incubarea la temperaturi sub 35 ° C produce halouri mai mari.

-Adăugarea de sânge scade dimensiunea sulfa halo.

Prescripţie

Sensibilitatea unui antibiotic demonstrat în antibiogramă față de un microorganism (in vitro) nu este o garanție că acesta va funcționa in vivo.

QA

Pentru a ști dacă mediul conține cantitatea adecvată de timină, trebuie plantată o tulpină de Enterococcus faecalis ATCC 29212 și trebuie testată susceptibilitatea la trimetoprim sulfametoxazol (SXT), trebuie să dea o halo egală cu sau> 20 mm pentru a fi satisfăcătoare.

Referințe

1. "Agar Müller-Hinton." Wikipedia, enciclopedia gratuită. 16 nov 2018, ora 12:23 UTC. 27 ianuarie 2019, 04:22
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnostic microbiologic Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
3. Cona E. Condiții pentru un studiu de susceptibilitate bun prin test de difuzie de agar. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77-81
4. Laboratorul Difco Francisco Soria Melguizo. Agar Müeller cu 5% sânge de oaie. 2009. Disponibil la: http://f-soria.es
5. Laboratorul BD Müeller Hinton II Agar. 2017. Disponibil la adresa: .bd.com
6. Laboratoarele Britannia. Müeller Hinton agar. 2015. Disponibil la adresa: britanialab.com
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosticul microbiologic. 5 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
8. Martínez-Rojas D. Betalactamaze de tip AmpC: Generalități și metode pentru detectarea fenotipică. Rev. Soc. Ven. Microbiol. 2009; 29 (2): 78-83. Disponibil pe: scielo.org.
9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. Detectarea fenotipică a metalobetalactamazelor în izolatele clinice ale Pseudomonas aeruginosa. Kasmera, 2012; 40 (2): 113-121. Disponibil pe: scielo.org.